胡 麗， 李 昕， 黃惠真， 李 偉

實(shí)驗(yàn)研究

5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力療法預(yù)防兔耳瘢痕增生的初步探討

胡 麗， 李 昕， 黃惠真， 李 偉

目的探討5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力療法抑制兔耳瘢痕增生的效果。方法建立兔耳增生性瘢痕模型后,將108個(gè)增生性瘢痕塊隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、單純激光組、單純5-氨基酮戊酸組及5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力治療組。5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力治療組在局部注射5-氨基酮戊酸后5 h行半導(dǎo)體激光照射，波長(zhǎng)635 nm，功率密度100 mW/cm2，照射20 min。治療后觀察3周瘢痕的生長(zhǎng)情況，測(cè)量瘢痕厚度及紅斑指數(shù)，取材后行HE染色，觀察真皮層厚度的變化，計(jì)算各組瘢痕增生指數(shù)，Masson染色觀察膠原纖維排列情況，TUNEL染色觀察成纖維細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力治療組瘢痕厚度與紅斑指數(shù)較其他3組均降低(P<0.05)；真皮層厚度明顯變薄，瘢痕增生指數(shù)較其他3組明顯降低(P<0.05)；Masson染色顯示，5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力治療組真皮層內(nèi)膠原纖維較其他3組減少，且排列整齊有序；TUNEL染色顯示，5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力治療組成纖維細(xì)胞凋亡數(shù)量較其他3組明顯增多(P<0.05)。結(jié)論應(yīng)用5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力療法可以預(yù)防兔耳瘢痕增生。

5-氨基酮戊酸； 光動(dòng)力療法； 增生性瘢痕

增生性瘢痕是創(chuàng)傷后組織過度修復(fù)的產(chǎn)物，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。傳統(tǒng)治療方法包括局部注射激素、口服藥物、放射治療以及手術(shù)等[1-5],其療效并不確切，可能伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此，對(duì)于增生性瘢痕，預(yù)防勝于治療。光動(dòng)力療法(photodynamic therapy, PDT)已經(jīng)成功用于治療淺表的惡性腫瘤[6]以及葡萄酒色斑等非腫瘤疾病[7]，其作用機(jī)制包括抑制局部血供和直接殺傷腫瘤細(xì)胞。鑒于增生性瘢痕與腫瘤存在相似的局部細(xì)胞增生和血供豐富的特性，自2012年1月至2013年12月，筆者采用5-氨基酮戊酸(aminolaevulinic acid, ALA)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法作用于兔耳增生性瘢痕模型，初步探討PDT預(yù)防增生性瘢痕的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器

新西蘭白兔12只均由本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。體質(zhì)量2.5～3.0 kg，6個(gè)月齡，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。光敏劑5-氨基酮戊酸(日本COSMOS BIO公司)，4 ℃避光保存；激光功率計(jì)(LP-3C型，中國(guó)北京物科光電技術(shù)有限公司)；635 nm半導(dǎo)體激光儀(HPD5230-HHLF-FAC型，美國(guó)HPD公司)；皮膚光度計(jì)(CR-400，日本美能達(dá)公司)；石蠟切片機(jī)(THERMO公司)；倒置顯微鏡(TS-100，日本NIKON公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立兔耳增生性瘢痕模型 肌肉注射麻醉后備皮，在每只兔耳腹側(cè)面于中線兩側(cè)遠(yuǎn)、中、近部位，遠(yuǎn)端創(chuàng)傷距兔耳尖端為2.0 cm，創(chuàng)傷間距1.0 cm,創(chuàng)傷距離兔耳內(nèi)外側(cè)緣1.5 cm,分別進(jìn)行直徑1.0 cm的圓形全層皮膚缺損6處，共144個(gè)，術(shù)中刮除軟骨膜，術(shù)后創(chuàng)面予以暴露，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面的愈合情況。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)過程 術(shù)后3周左右創(chuàng)面上皮化完成，表面痂皮脫落,出現(xiàn)瘢痕增生，質(zhì)地較硬、充血，瘢痕中央部呈乳頭狀凸起，144個(gè)創(chuàng)面共形成108個(gè)增生瘢痕塊，少部分創(chuàng)面瘢痕增生不明顯。將創(chuàng)面分成4組：空白對(duì)照組、單純激光組、單純ALA組與ALA-PDT組。空白對(duì)照組不予任何處理；單純激光組只照光，不給予ALA，激光輸出功率為0.315 W，光斑直徑2.0 cm,功率密度100 mW/cm2，能量密度120 J/cm2，照射20 min；單純ALA組每個(gè)瘢痕塊局部注射10 mg/ml ALA 0.2 ml，給藥后不照光；ALA-PDT組每個(gè)瘢痕塊局部注射10 mg/ml ALA 0.2 ml，給藥后避光5 h，再行激光照射，能量同上，不照光處給予遮蓋，治療后避光24 h。

1.2.3 觀察指標(biāo) 治療后1、2、3、7、14、21 d觀察瘢痕變化情況并拍照，游標(biāo)卡尺記錄各組瘢痕的高度，皮膚光度計(jì)測(cè)量瘢痕的紅斑指數(shù)。

1.2.4 標(biāo)本取材和處理 治療3周后取材，切取兔耳全層組織，周邊帶少許正常組織。4%甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，沿瘢痕凸起最高點(diǎn)縱行切片，行HE和Masson染色。HE染色后，光鏡下觀察治療后各組瘢痕組織的形態(tài)學(xué)變化，包括真皮層厚度以及成纖維細(xì)胞增生情況，使用ipp 6.0軟件測(cè)量瘢痕最高點(diǎn)與周圍正常組織的距離，計(jì)算瘢痕評(píng)估指數(shù)(scar evaluation index, SEI)。Masson染色觀察膠原纖維排列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)輸入Excel數(shù)據(jù)庫，采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

空白對(duì)照組增生塊明顯高于周圍正常皮膚，中央乳頭狀突起，顏色暗紅色，質(zhì)地較硬；單純激光組增生塊突出皮面明顯，顏色粉紅色，質(zhì)地較硬；單純ALA組瘢痕稍高出皮面，顏色呈粉紅，質(zhì)地較硬；ALA-PDT組瘢痕組織無明顯突出，色澤淡粉，質(zhì)地接近正常(圖1)。ALA-PDT組與其他3組相比，在治療后1周紅斑指數(shù)開始下降，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療后3周時(shí)瘢痕厚度和紅斑指數(shù)均有明顯下降，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 HE染色 治療后3周取材染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組、單純激光組與單純ALA組瘢痕組織的真皮層明顯增厚，主要由大量增生的成纖維細(xì)胞及排列紊亂的膠原纖維組成；而ALA-PDT組瘢痕組織的真皮層較其他3組明顯變薄，成纖維細(xì)胞和膠原纖維數(shù)量相對(duì)減少(圖2)。

2.2.2 SEI計(jì)算 空表對(duì)照組的SEI值為1.927；單純激光組SEI值為1.875；單純ALA組SEI值為1.837；ALA-PDT組SEI值為1.313，與其他3組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

2.2.3 Masson膠原纖維染色 空白對(duì)照組、單純激光組與單純ALA組真皮層內(nèi)可見大量排列緊密、紊亂粗大的綠染膠原纖維，淺層呈漩渦狀排列；ALA-PDT組真皮層內(nèi)綠染膠原纖維數(shù)量相對(duì)較少，排列規(guī)整(圖4)。

2.2.4 TUNEL染色 凋亡的細(xì)胞染色表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮，胞漿棕褐色深染。空白對(duì)照組、單純ALA組及單純激光組仍可見數(shù)量較多的成纖維細(xì)胞增殖，其間可見少量正常凋亡的成纖維細(xì)胞;ALA-PDT組鏡下發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)明顯減少，而其間凋亡的成纖維細(xì)胞明顯增多(圖5)。

圖1 實(shí)驗(yàn)前后大體觀察 a.空白對(duì)照組和單純激光組實(shí)驗(yàn)前 b.空白對(duì)照組和單純激光組實(shí)驗(yàn)后1周 c.空白對(duì)照組和單純激光組實(shí)驗(yàn)后3周 d.ALA-PDT組和單純ALA組實(shí)驗(yàn)前 e.ALA-PDT組和單純ALA組實(shí)驗(yàn)后1周 f.ALA-PDT組和單純ALA組實(shí)驗(yàn)后3周圖2 實(shí)驗(yàn)后3周各組真皮層厚度(HE ×200) a.空白對(duì)照組 b.單純激光組 c.單純ALA組 d.ALA-PDT組圖3 治療后3周各組間SEI比較圖4 治療后3周各組瘢痕Masson膠原染色(×200) a.空白對(duì)照組 b.單純激光組 c.單純ALA組 d.ALA-PDT組圖5 治療3周后各組瘢痕TUNEL染色(×200) a.空白對(duì)照組 b.單純激光組 c.單純ALA組 d.ALA-PDT組

Fig1 General observation before and after experiment. a. control group and laser irradiation group before experiment.b. control group and laser irradiation group after experiment at 1 week. c. control group and laser irradiation group after experiment at 3 weeks. d. ALA-PDT group and injection of ALA group before experiment. e. ALA-PDT group and injection of ALA group after experiment at 1 week. f. ALA-PDT group and injection of ALA group after experiment 3 weeks.Fig2 Dermal layer thickness of different groups after experiment at 3 weeks (HE×200). a. control group. b. laser irradiation group. c. injection ALA group. d. ALA-PDT group.Fig3 Comparison of SEI after experiment at 3 weeks.Fig4 Masson collagen staining after experiment at 3 weeks (×200). a. control group. b. laser irradiation group. c. injection ALA group. d. ALA-PDT group.Fig5 TUNEL staining after experiment at 3 weeks (×200). a. control group. b. laser irradiation group. c. injection ALA group. d. ALA-PDT group.

3 討論

增生性瘢痕的本質(zhì)在于成纖維細(xì)胞的過度增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，因此,成纖維細(xì)胞成為預(yù)防增生性瘢痕的關(guān)鍵因素之一。早期對(duì)增生性瘢痕的形態(tài)學(xué)研究結(jié)果已顯示,增生性瘢痕組織具有較普通瘢痕和正常真皮多的微血管結(jié)構(gòu)[8]。這種成纖維細(xì)胞過度增殖與局部血供豐富的病理生物學(xué)特性與腫瘤組織非常相似。1997年，DE Morris等發(fā)現(xiàn)，在兔耳創(chuàng)面上可以產(chǎn)生與人類病理瘢痕類似的真皮過度增生現(xiàn)象；1998年，李薈元等經(jīng)過大量兔耳創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)觀察，從多個(gè)角度研究了兔耳創(chuàng)面增生組織的特性，證實(shí)兔耳可以產(chǎn)生與人類增生性瘢痕相似的病理改變，并認(rèn)定可以作為瘢痕研究的動(dòng)物模型。

光動(dòng)力療法通過聯(lián)合應(yīng)用光敏劑及相應(yīng)光源引起的光化學(xué)反應(yīng)選擇性作用于病變組織，該反應(yīng)的機(jī)制在于光敏劑選擇性地積聚在異常增殖或增生活躍的組織細(xì)胞內(nèi)，通過吸收相應(yīng)波長(zhǎng)的激光能量發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，隨之產(chǎn)生大量活性氧自由基，尤其是單態(tài)氧，這些細(xì)胞毒性物質(zhì)將誘導(dǎo)靶細(xì)胞壞死或凋亡[9]；此外，PDT還可通過血管損傷機(jī)制間接清除靶組織而產(chǎn)生治療作用[10]。ALA作為第2代光敏劑之一，是細(xì)胞合成血紅素的前體，本身不具有光毒性作用，在體內(nèi)代謝快，其在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)一系列酶的作用下合成具有強(qiáng)光敏作用的原卟啉，然后繼續(xù)被代謝形成血紅素。ALA特征的吸收峰位于紅光區(qū)，作用波長(zhǎng)較長(zhǎng)，穿透較深，已廣泛應(yīng)用于多種皮膚淺表腫瘤等疾病[11-13]。

前期研究中，雞冠葡萄酒色斑模型已經(jīng)證實(shí)ALA- PDT可以造成局部血栓形成，阻斷治療部位組織的血液供應(yīng)[14]。在另一項(xiàng)研究中，人增生期瘢痕的成纖維細(xì)胞與ALA共培養(yǎng)后給予635 nm激光照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低強(qiáng)度的光照條件下，更多的成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，而高強(qiáng)度的光照條件下則導(dǎo)致細(xì)胞壞死[15]。以往研究也表明，采用PDT治療兔耳增生性瘢痕，瘢痕組織厚度變薄，TGF-β1表達(dá)降低，成纖維細(xì)胞凋亡增加[16-18]。

本研究初步觀察了ALA-PDT對(duì)兔耳瘢痕增生的抑制作用，根據(jù)觀察結(jié)果與光動(dòng)力療法作用機(jī)制，我們認(rèn)為其抑制作用與瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，此外，微血管數(shù)量有無減少仍在進(jìn)一步地研究中。

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Preventionofhypertrophicscarsby5-aminolaevulinicacid-mediatedphotodynamictherapyinarabbitearmodel

HULi,LIXin,HUANGHui-zhen,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,ShanghaiNinthPeople′sHospitalAffiliatedShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China)

ObjectiveTo investigate the effects of 5-aminolaevulinic acid-mediated photodynamic therapy (ALA-PDT) on hypertrophic scars in a rabbit ear model.MethodsThe acute model of dermal hypertrophic scar was established in the rabbit ears. Totally 108 scar wounds were randomly divided into 4 groups: the blank control group, the laser treatment group, the ALA injection group and the ALA-PDT group. In the ALA-PDT group, 5 h after intra-dermal injection of ALA, the scars were irradiated at 635 nm wavelength, 100 mW/cm2for 20 min. Three weeks after treatment, the scars thickness and erythema index were measured, and the specimens were harvested for histological analysis by HE and Masson staining.ResultsThe thickness, erythema index and the scar elevation index were significantly decreased while the number of apoptosis of fibroblasts increased in the ALA-PDT group compared to the other groups. Well organized collagen fiber was observed in the ALA-PDT group by Masson staining.ConclusionALA-PDT could prevent the growth of hypertrophic scars in rabbit ears.

5-aminolaevulinic acid; Photodynamic therapy; Hypertrophic scar

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071565)

200011 上海,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 整復(fù)外科(胡 麗，黃惠真，李 偉)；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 皮膚科(李 昕)

胡 麗(1989-)，女，安徽桐城人，碩士研究生.

李 偉,200011,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 整復(fù)外科，電子信箱：liweiboshi@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.11.020

R619.6

A

1673-7040(2014)11-0696-04

2014-10-10)