周 璐， 范巨峰

實驗研究

α-平滑肌肌動蛋白及纖溶酶原激活物抑制物-1在增生性瘢痕中的表達及意義

周 璐， 范巨峰

目的通過檢測分析α-平滑肌肌動蛋白及纖溶酶原激活物抑制物-1在增生性瘢痕及正常皮膚組織中表達的差異，闡明α-平滑肌肌動蛋白及纖溶酶原激活物抑制物-1與增生性瘢痕的關(guān)系及意義。方法通過熒光免疫組織化學的方法檢測9例增生性瘢痕和9例正常皮膚組織中α-平滑肌肌動蛋白和纖溶酶原激活物抑制物-1的含量與分布，用共聚焦顯微鏡觀察并拍照，用ImageJ軟件處理共聚焦顯微鏡圖像分別獲得正常皮膚組織與增生性瘢痕中α-平滑肌肌動蛋白和纖溶酶原激活物抑制物-1的平均熒光強度。通過熒光免疫組化、共聚焦顯微鏡及ImageJ軟件3種方法，定量分析 α-平滑肌肌動蛋白和纖溶酶原激活物抑制物-1與增生性瘢痕的關(guān)系。結(jié)果α-平滑肌肌動蛋白和纖溶酶原激活物抑制物-1在正常組織與增生性瘢痕組織中均有表達，但表達量及分布有所差別。通過分析熒光免疫組化圖像中α-平滑肌肌動蛋白和纖溶酶原激活物抑制物-1的平均熒光強度發(fā)現(xiàn)：①α-平滑肌肌動蛋白在增生性瘢痕中的表達量較正常皮膚組織明顯增高，差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；②纖溶酶原激活物抑制物-1在增生性瘢痕與正常皮膚組織中的表達，差異無明顯的統(tǒng)計學意義(P>0.01)。結(jié)論在正常皮膚與增生性瘢痕中，均有α-平滑肌肌動蛋白和纖溶酶原激活物抑制物-1的表達，α-平滑肌肌動蛋白在增生性瘢痕中的表達量明顯高于正常皮膚組織，表明α-平滑肌肌動蛋白對增生性瘢痕的形成有一定意義；纖溶酶原激活物抑制物-1在增生性瘢痕與正常皮膚組織中的表達量差異無明的顯統(tǒng)計學意義。

增生性瘢痕; α-平滑肌肌動蛋白; 纖溶酶原激活物抑制物-1; 熒光免疫組織化學

人體創(chuàng)傷的修復會導致瘢痕形成，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的病理學特征是成纖維細胞的增殖及基質(zhì)蛋白的過度沉積[1]。增生性瘢痕與瘢痕疙瘩相比，具有攣縮的特性。增生性瘢痕的攣縮與細胞骨架運動密切相關(guān)，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin， α-SMA)則起到關(guān)鍵的作用[2]。 在組織器官纖維化的病理過程中纖溶系統(tǒng)有重要的作用[3]，纖溶酶原激活物抑制物-1(plaminogen activator inhibitor-1, PAI-1)在瘢痕疙瘩中表達明顯增高，但PAI-1與增生性瘢痕相關(guān)文獻較少，二者關(guān)系至今并不明確。自2013年3月至2014年1月，筆者對α-SMA及PAI-1在增生性瘢痕和正常皮膚組織的表達是否存在差異進行了研究，從而為進一步地研究提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 標本來源 標本均來自首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院整形外科的手術(shù)患者，共18例，實驗組與對照組所取組織均為手術(shù)中棄去組織。實驗組增生性瘢痕9例。男性4例，女性5例；年齡15～42歲。形成時間1個月至2年，瘢痕組織取自面部、頸部及手部，受傷原因為燒傷及手術(shù)切口；對照組正常皮膚9例。男性3例，女性6例；年齡17～34歲。正常組織取自額部、眼瞼及頸部，患者無病理性瘢痕家族史。

1.2 主要試劑 一抗抗體：兔抗人Anti-PAI1，Anti-alpha smooth muscle Actin antibody，均購自英國ABCAMBCAM公司；二抗抗體：羊抗兔DyLight 594 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG, DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG antibody，均購自美國EARTHOX公司；DAPI，武漢博士德生物公司。

1.3 實驗方法 選用熒光免疫組化、共聚焦顯微鏡和ImageJ軟件分析3種方法，利用對共聚焦顯微鏡拍照并分析圖像，確定α-SMA及PAI-1在增生性瘢痕及正常皮膚組織中的表達量。實驗步驟如下：①將組織用4%多聚甲醛固定12～14 h，用OCT包埋后冷凍切片機切片，厚度為30 μm；②用5%BSA將標本室溫封閉1～2 h；③將一抗Anti-PAI-1及Anti-α-SMA抗體加入標本組織，抗體濃度為1∶100，在冰箱4 ℃放置12～14 h；④用PBS沖洗3次，每次5 min。沖洗完畢后，加入熒光二抗及細胞核染料DAPI，避光操作。熒光二抗抗體濃度為1∶200，室溫孵育1.5～2.5 h；⑤用PBS沖洗4次，每次5 min。沖洗完畢后用抗熒光猝滅劑封片；⑥用Zeiss710-3channel激光共聚焦顯微鏡觀察，設(shè)定參數(shù)后拍照，嚴格控制拍照條件；⑦使用ImageJ處理圖像，分別得到每個樣本中α-SMA和PAI-1的平均熒光強度，再通過SPSS 17.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 α-SMA在增生性瘢痕組織與正常皮膚組織中的表達 α-SMA在增生性瘢痕中的表達比在正常皮膚組織中明顯增加。增生性瘢痕中α-SMA排列成束，方向一致整齊；正常皮膚組織中α-SMA多位于血管周圍，表達量較少，與瘢痕組織中α-SMA分布差異明顯(圖1)。PAI-1在增生性瘢痕及正常組織中均有表達。正常皮膚組織中PAI-1在真皮表達廣泛，表皮表達較少；在增生性瘢痕中PAI-1表達部位無明顯差異(圖2)。

2.2 用ImageJ軟件分析 共聚焦圖像中增生性瘢痕組織與正常皮膚組織中α-SMA及PAI-1的平均熒光強度，見表1,2。

3 討論

增生性瘢痕與瘢痕疙瘩的特點是大量的成纖維細胞增生，胞外基質(zhì)中膠原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖等過度沉積，膠原纖維呈束狀排列，喪失正常皮膚附屬器的結(jié)構(gòu)與功能[4]。在增生性瘢痕中，α-SMA是肌成纖維細胞的標志物之一，通常認為肌成纖維細胞可以表達α-SMA[5]。在肌成纖維細胞中,α-SMA的肌動蛋白微絲終末端位于肌成纖維細胞表面的一種附著復合物上，通過跨膜整合素與胞外纖連蛋白相連[6]。正常傷口愈合過程中,肌成纖維細胞暫時性表達,可引起傷口的收縮,隨著真皮再塑形,含有α-SMA的肌成纖維細胞會凋亡消失,而病理性的愈合則可能使其持續(xù)表達[7]。Wang等[8]在豬的燒傷動物模型中發(fā)現(xiàn)，α-SMA的表達量和瘢痕的大小成反比，α-SMA表達量越高，瘢痕面積越小，并且會影響瘢痕的厚度和上皮再生的時間。陳蕾等[9]的研究結(jié)果表明，攣縮瘢痕組織中α-SMA、β-及γ- 胞質(zhì)肌動蛋白均表達增加，在去除-SMA基因的小鼠中，創(chuàng)面收縮受抑制，TGF- 1可在一定范圍內(nèi)提高創(chuàng)面肉芽組織的收縮性，但其程度不及表達α-SMA的創(chuàng)面收縮性。作者認為，α-SMA是肌成纖維細胞產(chǎn)生及引發(fā)創(chuàng)面收縮、瘢痕攣縮的必要條件。

圖1 共聚焦顯微鏡下增生性瘢痕組織與正常組織中α-SMA熒光免疫組化染色的表達情況 a.瘢痕組織(×6) b.瘢痕組織(×10) c.瘢痕組織(×24) d.瘢痕組織(×40) e.正常組織(×6) f.正常組織(×10) g.正常組織(×24) h.正常組織(×40)圖2 共聚焦顯微鏡下增生性瘢痕與正常組織中PAI-1熒光免疫組化染色的表達情況 a.瘢痕組織(×6) b.瘢痕組織(×10) c.瘢痕組織(×24)d.瘢痕組織(×40) e.正常組織(×6) f.正常組織(×10) g.正常組織(×24) h.正常組織(×40)

Fig1 Expression of α-SMA immunofluorescence staining in hypertrophic scar tissue and normal tissue under microscopy. a. hypertrophic scar tissue (×6). b. hypertrophic scar tissue (×10). c. hypertrophic scar tissue (×24). d. hypertrophic scar tissue (×40). e. hypertrophic scar tissue (×6). f. hypertrophic scar tissue (×10). g. hypertrophic scar tissue (×24). h. hypertrophic scar tissue (×40).Fig2 Expression of PAI-1 immunofluorescence staining in hypertrophic scar tissue and normal tissue under microscopy. a. hypertrophic scar tissue (×6).b. hypertrophic scar tissue (×10). c. hypertrophic scar tissue (×24). d. hypertrophic scar tissue (×40). e. hypertrophic scar tissue (×6). f. hypertrophic scar tissue (×10). g. hypertrophic scar tissue (×24). h. hypertrophic scar tissue (×40).

表1 α-SMA在增生性瘢痕與正常皮膚組織中的平均熒光強度

注：P<0.01(P=0.001)，在增生性瘢痕中α-SMA的表達量明顯高于正常皮膚組織

表2 PAI-1在增生性瘢痕與正常皮膚組織中的平均熒光強度

注：P>0.01(P=0.117)，PAI-1在增生性瘢痕及正常皮膚組織中表達量無明顯差異

我們的研究結(jié)果與大多數(shù)作者的結(jié)果一致，同樣證實了α-SMA在增生性瘢痕中的表達比正常組織高。因此，我們在本實驗的第2部分采用此方法研究PAI-1在增生性瘢痕中的表達。我們運用熒光免疫組化法、共聚焦顯微鏡和ImageJ軟件分析蛋白的表達量。PAI-1屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，是尿激酶型纖溶酶原激活物及組織型纖溶酶原激活物的主要生理抑制劑，由血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、肝細胞等合成分泌[10]。

PAI-1與瘢痕疙瘩的形成有密切關(guān)聯(lián)[11]。Tuan實驗室發(fā)表了比較普通瘢痕與瘢痕疙瘩之間PAI-1及uPA的表達情況，結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩成纖維細胞PAI-1的表達量比普通瘢痕高，同時膠原蛋白的沉積也增多。 Tuan等[12]認為，PAI-1的過表達是瘢痕疙瘩的特征，并且認為，PAI-1可能是膠原蛋白產(chǎn)生與沉積的重要始動因素。PAI-1與瘢痕疙瘩的相關(guān)性是較為明確的。PAI-1與增生性瘢痕的相關(guān)文獻很少。孫波[13]認為，PAI-1在增生性瘢痕中的表達上調(diào)，PAI-1 mRNA在增生性瘢痕中的相對表達量約為正常皮膚組織的2.7倍。

實驗采用共聚焦圖像來分析PAI-1在正常皮膚組織與增生性瘢痕中表達，結(jié)果顯示，PAI-1在正常皮膚組織與增生性瘢痕中的表達量無明顯差異，與文獻結(jié)果不同。我們對孫波的研究結(jié)果分析認為尚存在一些問題：①文章中樣本量(6例)較少；②實驗中實時熒光定量PCR的內(nèi)參基因選擇β-actin基因是不可靠的；③研究結(jié)果的相對定量采用2-△△Ct法進行比較，計算結(jié)果是估計值，并不準確。

我們發(fā)現(xiàn)，PAI-1是TGF-β的下游信號分子。Bock等[14]的研究結(jié)果表明，TGF-β3在增生性瘢痕和正常皮膚組織中的表達量無差異。因此，我們認為，PAI-1在增生性瘢痕與正常皮膚組織中含量無差異，可能是由于TGF-β3在增生性瘢痕和正常皮膚組織中的表達量無差異所致。

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Expressionandsignificanceofα-smoothmuscleactinandplaminogenactivatorinhibitor-1inthehypertrophicscar

ZHOULu,FANJu-feng.

(DepartmentofPlasticSurgery,BeijingChaoyangHospital,Beijing100020,China)

ObjectiveExpression and significance of α-smooth muscle actin and plaminogen activator inhibitor-1 in hypertrophic scar. To illustrate the expression and significance of α-smooth muscle actin and plaminogen activator inhibitor-1 in hypertrophic scar, we detect and analyze the expression quantity of α- and plaminogen activator inhibitor-1 in the hypertrophic scar and normal skin.MethodsWe use immunohistochmeistry to sign the expression of α-smooth muscle actin and plaminogen activator inhibitor-1 in 9 cases of hypertrophic scar and 9 cases of normal skin, then we can take photos with laser scanning confocal microscope and process images with ImageJ software. We can get the mean density of α-smooth muscle actin and plaminogen activator inhibitor-1 in hypertrophic scar and normal skin, after that we can analyze the relationship between α-smooth muscle actin/plaminogen activator Inhibitor-1 and hypertrophic scar.Results①In hypertrophic scar and normal skin, α-smooth muscle actin and plaminogen activator inhibitor-1 could express in both of them but there are some differences in expression quantity and distribution. ②Through analysis the mean density of α-smooth muscle actin and plaminogen activator inhibitor-1, we could find that the expression of α-smooth muscle actin is higher in hypertrophic scar and the difference between the two groups have remarkable statistical significance (P<0.01); the expression of plaminogen activator inhibitor-1 has no statistically significant difference between hypertrophic scar and normal skin (P>0.01).ConclusionBoth of α-smooth muscle actin and plaminogen activator inhibitor-1 are expressed in hypertrophic scar and normal skin. The expression of α-smooth muscle actin is higher in hypertrophic scar and shows important role in hypertrophic scar. The expression of plaminogen activator inhibitor-1 shows no statistically significant difference between hypertrophic scar and normal skin.

Hypertrophic scar; α-smooth muscle actin; Plaminogen activator inhibitor-1; Immunohistochmeistry

100020 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院 整形外科

周 璐(1988-)，女，山西人，碩士研究生.

范巨峰，100020，首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院 整形外科，電子信箱： bestfan@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.11.019

R619.6

A

1673-7040(2014)11-0692-04

2014-09-25)