卞 愧，林 濤，劉 敏，楊建文，王宗楠，賀利民*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理毒理研究室，廣東 廣州 510642；2.東莞出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 東莞 523000）

β-興奮劑主要用于防治人、獸支氣管哮喘及痙攣［1］，由于其可提高動物的飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，常被非法用作飼料添加劑。但長期使用或濫用β-興奮劑會造成其在可食性動物組織中殘留，人食用后會引起肌肉震顫、心悸和過敏等急性中毒，世界上大多數(shù)國家已禁止其作為生長促進劑應(yīng)用于食品動物生產(chǎn)［2］。建立科學(xué)、可靠的β-興奮劑殘留分析檢測方法具有重要意義。

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects，ME)一般指試樣中的非待測組分影響待測物濃度或質(zhì)量測定的準確度、引起待測物響應(yīng)值增加或減少的現(xiàn)象［3-5］。隨著植物源基質(zhì)中農(nóng)藥殘留測定中基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象研究的深入和措施的有效實施［6-8］，動物源基質(zhì)中獸藥殘留測定中的基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象已引起國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，已有分別從樣品提取［9］、液液萃?。?0］和固相萃取凈化［11］、同位素標記［12，13］及去除基質(zhì)中的磷脂［14］等方面進行的考察，在減少和補償基質(zhì)效應(yīng)的措施方法上都取得了較大的進展，但這些研究大都是探討液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式下的基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象，涉及β-興奮劑殘留測定中的基質(zhì)效應(yīng)研究相對較少［15-17］。為此，本研究在已有 β-興奮劑殘留分析檢測方法基礎(chǔ)上［18］，探討氣相色譜-質(zhì)譜法測定豬肝和肌肉組織中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺等β-興奮劑殘留的基質(zhì)效應(yīng)，研究不同狀態(tài)(新鮮與凍干粉)及不同重量的豬組織試樣產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)差異，為有效消除或補償β-興奮劑殘留測定中的基質(zhì)效應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010(日本島津公司)；IKA高速組織勻漿機(德國 IKA公司)；凍干機(德國Christ公司)；純水機(德國Millipore公司)。

萊克多巴胺對照品(含量≥98.5%)、克倫特羅對照品(含量≥98.5%)、沙丁胺醇對照品(含量≥98.5%)均購自德國 Dr.Ehrenstorfer公司；N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(99+1，v/v)(Sylon BFT)衍生劑(美國 Sigma-Aldrich公司)；甲苯(色譜純)(美國Fisher公司)；乙腈等其他試劑均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

β-興奮劑標準儲備液(100 mg/L):分別準確稱取克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺對照品10 mg，用甲醇溶解，定容至100 mL，-20℃避光保存。

β-興奮劑混合標準工作液:取適量各標準儲備液，用甲醇稀釋配制成3種 β-興奮劑的混合標準溶液。

1.2 樣品處理

1.2.1 豬組織凍干粉的制備

分別準確稱取1、2、4、5及10 g豬肉和豬肝組織勻漿于西林瓶中(西林瓶先恒重，稱量)，于-80℃冰箱冷凍12 h，轉(zhuǎn)到冷凍干燥機上于-80℃真空冷凍24 h，再次稱重后待提取。

1.2.2 豬組織鮮樣和凍干粉的前處理

西林瓶中的豬組織凍干粉用15 mL乙腈和1 mL 10%(質(zhì)量分數(shù))的碳酸鈉溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，渦旋，超聲5 min，振蕩20 min，于4℃下以8000 r/min離心10 min。分取1 mL上清液于有塞玻璃試管中，50℃水浴氮氣吹干。同時，稱取與凍干組織相應(yīng)重量的各鮮樣同步處理。

將吹干的樣品試管置于80℃烘箱中干燥5 min，取出分別加入100 μL 甲苯和100 μL BFT 衍生劑，渦旋混合30 s，放入烘箱衍生1 h；取出冷卻后用甲苯定容至500 μL，渦旋混合，上機檢測。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:毛細管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度:250℃；爐溫程序:初始溫度70℃，保持1 min，然后以35℃/min升至220℃，保持1 min，以35℃/min升至280℃，再以10℃/min升至290℃，保持4 min；載氣:高純氦氣；柱流速0.8 mL/min，不分流進樣。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子(EI)源:源溫230℃；電子能量:70 eV；接口溫度:290℃。選擇離子監(jiān)測(SIM)方式，克倫特羅特征離子:m/z 86(定量離子)、212、262、277；沙丁胺醇特征離子:m/z 86、350、369(定量離子)、440；萊克多巴胺特征離子:m/z 179、234、250(定量離子)、502。

1.4 基質(zhì)效應(yīng)評價方法

按照Matuszewski等［12］提出的提取后添加法定量評價基質(zhì)效應(yīng)強度。分別測定空白提取液與純?nèi)軇┲刑砑油瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強度，計算二者的相對比值來評價基質(zhì)效應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行多因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

參考農(nóng)業(yè)部1031號公告-3-2008標準及文獻［19］優(yōu)化儀器條件，實驗表明，使用 HP-5MS毛細管色譜柱在優(yōu)化的色譜條件下目標分析物具有良好的色譜行為，可與雜質(zhì)實現(xiàn)有效分離。采用全掃描模式獲得3種β-興奮劑藥物的三甲基硅醚衍生物的質(zhì)譜圖如圖1所示，據(jù)此選擇每種分析物靈敏度相對較高和穩(wěn)定的4個碎片離子進行定性、定量分析。

圖1 3種分析物的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of the three β-agonist drugs

2.2 豬組織凍干粉的相對重量

根據(jù)不同稱樣量時豬組織試樣凍干前后的重量計算豬肝臟和肌肉凍干粉占相應(yīng)鮮肝臟和肌肉的相對重量分別為30.8%～35.0%和28.2%～30.0%，如圖2所示。

2.3 鮮豬肝臟與其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)比較

圖2 豬肝臟和肌肉凍干粉占相應(yīng)鮮組織的相對重量(n=3)Fig.2 Relative weight of freeze-dried pig liver and muscle to their corresponding fresh samples(n=3)

采用1.2節(jié)前處理方法和1.3節(jié)儀器條件檢測，3種β-興奮劑呈現(xiàn)顯著的基質(zhì)增強效應(yīng)。考察豬肝臟基質(zhì)狀態(tài)和基質(zhì)重量2個因素對3種分析物ME的影響。SPSS多因素方差分析表明，樣品狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)對3種分析物ME的影響差異不顯著(P＞0.05)；基質(zhì)重量對3種分析物響應(yīng)的影響差異均顯著(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 豬肝狀態(tài)及重量對3種分析物基質(zhì)效應(yīng)的影響Table 1 Influence of pig liver state and its weight on matrix effects of the three analytes

進一步分析基質(zhì)狀態(tài)(鮮豬肝及其凍干粉)對ME的影響。鮮肝臟中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為179%、317%及1076%，肝臟凍干粉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為178%、312%及1081%，二者間各藥物的基質(zhì)效應(yīng)差異均不顯著(P＞0.05)。由于在凍干的過程中，只是失去了動物組織中的水，其他成分沒有變化，在本研究優(yōu)化的前處理方法條件下，鮮樣與其相應(yīng)凍干粉的基質(zhì)提取成分類似，所以目標分析物的基質(zhì)效應(yīng)無顯著差異。

采用GC-MS分析3種藥物存在高的基質(zhì)增強效應(yīng)，特別是基質(zhì)中萊克多巴胺的響應(yīng)是純?nèi)軇┲械?0倍以上，使用基質(zhì)匹配標準校正尤為重要。鮮豬肝及其相應(yīng)凍干粉中3種β-興奮劑的典型選擇離子色譜圖見圖3。

圖3 純?nèi)軇┡c豬肝組織試樣添加3種β-興奮劑的選擇離子色譜圖Fig.3 Typical ion chromatograms of the three β-agonists in pure solvent and the spiked pig liver samples

鮮豬肝與其凍干粉的實驗結(jié)果表明，試樣中水分對3種β-興奮劑ME的影響較小，豬肝凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)與相應(yīng)豬肝臟新鮮組織產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)相當。在實際樣品中β-興奮劑殘留分析測定時，可以考慮用處理好的凍干粉萃取物來配制基質(zhì)匹配標準溶液，以提高殘留分析的科學(xué)性和準確性，凍干粉與鮮樣匹配重量可以參考圖2結(jié)果。同時，單因素方差分析表明，1 g和2 g豬肝樣品中克倫特羅的ME與其他實驗豬肝重量樣品間的ME差異顯著(P＜0.05)，沙丁胺醇的ME只有4 g與5 g樣品間的ME差異不顯著(P＞0.05)，其他樣品間差異顯著(P＜0.05)；不同豬肝重量間萊克多巴胺的ME差異均顯著(P＜0.05)。這表明試樣重量對不同化合物的基質(zhì)效應(yīng)的影響是不同的。隨著試樣基質(zhì)重量增加，其干物質(zhì)的量也相應(yīng)增加，干物質(zhì)中含有的基質(zhì)效應(yīng)物質(zhì)也隨之增加，從而導(dǎo)致ME在一定范圍內(nèi)隨重量增加而增強；當樣品重量增加到一定程度時，可能是一定量的提取液可以提取出來的基質(zhì)效應(yīng)物質(zhì)的量達最大，所以ME不再繼續(xù)增強。因此，在一定條件下，稱取合適重量的樣品進行殘留分析也是值得考慮的。不同重量豬肝中3種β-興奮劑的ME大小見圖4。

圖4 樣品重量對豬肝臟與肌肉組織中3種β-興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)影響(n=3)Fig.4 Influence of sample weight on matrix effects of the three β-agonists in pig liver and muscle tissues(n=3)

2.4 鮮豬肉與其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)比較

多因素方差分析表明，豬肉基質(zhì)狀態(tài)和基質(zhì)重量對3種分析物ME的影響與豬肝中類似，豬肉樣品狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)對3種分析物的ME的影響差異不顯著(P＞0.05)，豬肉重量對3種分析物的ME影響顯著(P＜0.05)，結(jié)果見表2。

表2 豬肉狀態(tài)及重量對3種分析物基質(zhì)效應(yīng)的影響Table 2 Influence of state of pig muscle and its weight on matrix effects of the three analytes

依據(jù)上述ME的計算方法，鮮豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為244%、295%及918%，豬肉凍干粉中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺的ME分別為262%、301%及920%。單因素方差分析表明，鮮豬肉及其凍干粉中3種β-興奮劑的ME與豬肝中的分析結(jié)果類似，二者ME差異不顯著(P＞0.05)，進一步說明因鮮豬組織與其相應(yīng)凍干粉的基質(zhì)提取成分類似，所以目標分析物的基質(zhì)效應(yīng)無顯著差異。鮮豬肉及其相應(yīng)凍干粉中3種β-興奮劑的典型選擇離子色譜圖見圖5。

進一步比較不同重量豬肉的ME，克倫特羅的ME 為5 g＞10 g＞4 g＞2 g＞1 g，1 g樣品與4 g、5 g及10 g樣品，2 g樣品與5 g樣品的ME差異顯著(P＜0.05)；沙丁胺醇的ME為5 g＞10 g＞4 g＞2 g＞1 g，只有5 g與10 g樣品的 ME差異不顯著(P＞0.05)，其他樣品差異顯著(P＜0.05)；萊克多巴胺的ME為5 g＞4 g＞10 g＞2 g＞1 g，只有4 g與10 g樣品的ME差異不顯著(P＞0.05)，其他重量樣品的ME差異顯著(P＜0.05)。單因素方差分析表明，在一定的重量范圍內(nèi)(1～5 g)，與豬肝組織類似，ME隨著樣品重量增大而增強；但為什么當樣品重量大于5 g時，豬肉組織中3種分析物的ME均隨樣品重量增加而減小，是否是提取不完全還需深入實驗研究。不同重量豬肉中3種β-興奮劑的ME見圖4。

3 結(jié)論

圖5 純?nèi)軇藴逝c豬肉組織試樣添加3種β-興奮劑的選擇離子色譜圖Fig.5 Typical ion chromatograms of the three β-agonists in pure solvent and the spiked pig muscle samples

本實驗系統(tǒng)評價了GC-MS檢測模式下，不同基質(zhì)重量、不同基質(zhì)狀態(tài)(鮮樣和凍干粉)的豬肝臟和肌肉組織中克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺等3種β-興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)。方差分析結(jié)果表明:不同基質(zhì)重量的基質(zhì)效應(yīng)差異顯著(P＜0.05)，不同基質(zhì)狀態(tài)豬肝臟和肌肉組織的鮮樣及其凍干粉的基質(zhì)效應(yīng)差異不顯著(P＞0.05)。豬可食性組織相應(yīng)凍干粉有望作為通用基質(zhì)，用于GC-MS測定β-興奮劑殘留中基質(zhì)效應(yīng)的校正，也為動物性食品中藥物殘留檢測的基質(zhì)效應(yīng)研究提供理論基礎(chǔ)。

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