李龍飛，蘇 敏，石曉蕾，王亞娜，王玟玟，何金興

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東 濟南 250353）

雌激素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、分子中含有18個碳原子的類固醇激素［1］，該類物質(zhì)可通過模擬或拮抗正常的內(nèi)源性激素，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，進而對生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生影響。己烷雌酚(HEX)、己烯雌酚(DES)和雙烯雌酚(DS)屬于人工合成的雌激素，對動物具有顯著的促生長作用，曾在多國被作為促生長劑廣泛用于畜牧業(yè)［2］。但如今越來越多的研究表明雌激素可對人和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重干擾，且具有潛在的致癌性［3-6］。鑒于此，美國、歐盟等多國已明文規(guī)定對其禁用或限用，我國也在2002年明確規(guī)定對其禁用［7］。

溶膠凝膠技術(shù)是一種非常有發(fā)展前途的材料制備方法，該方法反應(yīng)條件溫和，可用于制備粒徑不同、形狀各異的無機材料和具有特定官能團的無機-有機雜化材料，所得材料具有穩(wěn)定性好、選擇性高、傳質(zhì)速度快等優(yōu)點［8，9］。本實驗以溶膠凝膠技術(shù)合成的聚合物為固相萃取填料，考察制備的固相萃取材料對HEX、DES和DS 3種雌激素的吸附效果。

目前針對獸藥殘留常用的檢測方法有固相萃取-高效液相色譜法(SPE-HPLC)［10，11］、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)［4，12］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)［13，14］等。上述方法的檢出限雖能在一定程度上滿足一般獸藥殘留檢測的要求，但都有不足之處，如SPE-HPLC因離線富集易造成樣品損失，導(dǎo)致測量誤差，且完成一次檢測耗時較長；HPLC-MS價格昂貴，一般實驗室難以推廣，不適于日常樣品的檢測；GC-MS使用時一般需要進行繁瑣的樣品衍生化處理，耗時費力。本研究以不銹鋼在線富集管代替液相色譜進樣環(huán)，采用在線固相萃取-HPLC法進行分析，建立了同時測定水樣中3種雌激素殘留的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-M20A二極管陣列檢測器(日本島津公司)；梅特勒AL104電子天平(中國梅特勒-托利多公司)。

DES、DS、HEX(色譜純，Sigma 公司)；乙腈、甲醇、乙醇(色譜純，天津化學(xué)試劑廠)；二次去離子水(DDW，18 MΩ·cm，Milli-Q超純水器制得)；四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS；分析純)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，APTES；分析純)。

標準儲備溶液:稱取 DES、DS、HEX 各 2 mg，用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，配成200 mg/L的混合標準儲備液，于4℃條件下保存。根據(jù)需要，臨用時用純水稀釋成相應(yīng)濃度的標準工作溶液。

1.2 實際水樣的采集與預(yù)處理

礦泉水于山東濟南長清地區(qū)超市購得；自來水于山東濟南長清地區(qū)學(xué)校采得。收集的水樣經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾，置于棕色試劑瓶中，于4℃保存。使用時先用0.1 mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件的選擇

色譜柱 Xterra C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm；Waters，USA)；流動相為甲醇和1%乙酸水溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為38℃，進樣量為20 μL，檢測波長為230 nm。采用保留時間定性，外標法峰面積定量。

1.3.2 固相萃取柱的制備

將5 mL乙腈注入50 mL具塞的圓底燒瓶中，加入1 mL APTES，磁力攪拌反應(yīng)30 min；加入2 mL TEOS，繼續(xù)攪拌20 min；再加入1 mL 0.01 mol/L醋酸，磁力攪拌10 min，置于水浴鍋中于60℃下孵化10 h，過濾，用甲醇洗滌，于真空干燥箱中100℃下老化10 h［9］。將所得材料研磨成粉備用。在空的在線富集管內(nèi)依次填入0.45 μm有機濾膜、石英棉(經(jīng)10%硝酸活化)、70 mg合成材料、石英棉(經(jīng)10%硝酸活化)、0.45 μm有機濾膜，以此作為固相萃取柱，用于預(yù)富集。

1.3.3 在線預(yù)富集步驟

固相萃取在線富集與高效液相色譜法聯(lián)用裝置參見文獻［15］，測定水樣中雌激素殘留的過程如下:首先，將高效液相色譜儀的進樣閥扳到進樣位，在流動注射分析儀的作用下，樣品溶液進入裝有吸附材料的固相萃取柱中進行富集，廢液通過廢液管流出。然后，將進樣閥扳到注射位，以使流動相流過富集柱，富集的雌激素在流動相的作用下進入到色譜分離柱前的管道中。最后，洗脫完成后將進樣閥再次扳到進樣位，以進行下一次富集；與此同時分析物在色譜柱中被分離。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

分別以乙腈和1%乙酸水溶液、甲醇和1%乙酸水溶液作為流動相，考察了不同比例流動相對3種雌激素分離效果的影響。經(jīng)測試，兩種有機溶劑與1%乙酸水溶液在一定配比下均可對3種雌激素實現(xiàn)分離，但考慮到乙腈對人體的影響，最終選用甲醇和1%乙酸水溶液作為流動相進行分離。試驗結(jié)果表明甲醇和1%乙酸水溶液比例為64∶36(v/v)時，3種雌激素在16 min內(nèi)能夠達到完全的基線分離，且峰形對稱性良好(見圖1)。

2.2 影響雌激素在線富集的因素

為了使合成材料對雌激素具有理想的富集效果，分別對洗脫溶劑、樣品溶液pH、上樣流速等影響富集效果的因素進行了優(yōu)化。

圖1 3種雌激素混合標準溶液(1 mg/L)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed standard solution of the three estrogens(1 mg/L)

2.2.1 洗脫溶劑的選擇

配制10 μg/L的雌激素混合標準溶液進行在線富集，在樣品溶液體積為100 mL，上樣流速為1 mL/min，洗脫流速為1 mL/min條件下，考察了不同比例的1%乙酸水溶液和甲醇、1%乙酸水溶液和乙腈、1%乙酸水溶液和乙醇作為洗脫溶劑的洗脫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇對于富集在吸附材料上的雌激素幾乎沒有洗脫效果，而乙腈的洗脫效果明顯不如甲醇，由此選擇1%乙酸水溶液和甲醇作為洗脫溶劑。考慮到本實驗3種雌激素的最佳分離條件，最終選擇流動相的配比作為洗脫溶劑的配比。

2.2.2 樣品溶液的pH對富集效果的影響

配制 10 μg/L，pH 分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的雌激素混合標準溶液100 mL(采用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值)，控制流速為1 mL/min進行在線富集，洗脫流速同樣為1 mL/min，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，pH對雌激素的富集效果具有較大的影響，當(dāng)pH在5.0～7.0時，3種雌激素的峰面積均隨pH的升高而增大；而當(dāng)pH超過7.0時，峰面積顯著下降，可能的原因是所合成的固相萃取填料是一種中等極性的化合物，在酸性或中性條件下，有利于填料與雌激素之間氫鍵的形成，因而具有較高的吸附性。由此最終選擇樣品溶液的pH為7.0用于后續(xù)的試驗。

2.2.3 上樣流速對富集效果的影響

對100 mL 10 μg/L的雌激素混合標準溶液在線富集，調(diào)節(jié)蠕動泵的轉(zhuǎn)速，逐步增加上樣速度，以考察上樣流速對3種雌激素吸附效果的影響。結(jié)果表明，上樣流速在1～4 mL/min范圍內(nèi)，3種雌激素的色譜峰面積隨上樣流速的增加一直呈下降趨勢，但過慢的上樣流速勢必會影響到整個富集分析過程的效率。綜合考慮，最終選擇2 mL/min作為適宜的上樣流速。

圖2 樣品溶液pH對雌激素富集效果的影響Fig.2 Effect of pH of the sample solution on extraction efficiencies of the estrogens

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 直接進樣測定的標準曲線

將3種分析物的混合標準液稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、8、10 mg/L的系列標準溶液，依次進樣分析，每個濃度樣品平行測定3次，對分析物的峰面積(Y，μV·s)與質(zhì)量濃度(X，mg/L)進行線性回歸，繪制標準曲線。3種雌激素的線性方程見表1。

表1 3種雌激素的線性方程與相關(guān)系數(shù)(R2)Table 1 Regression equations and correlation coefficients(R2)of the three estrogens

2.3.2 方法的線性關(guān)系、精密度和檢出限

為了考察方法的線性關(guān)系，配制質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、8、10 μg/L 的 3 種雌激素混合標準工作液，在線富集100 mL，每個濃度樣品平行測定3次，對分析物的峰面積(Y，μV·s)與質(zhì)量濃度(X，μg/L)進行線性回歸，所得線性方程即為富集標準曲線方程(見表2)。以5 μg/L的混合標準工作液富集100 mL，重復(fù)測定5次，計算各待測組分的平均峰面積，計算方法的相對標準偏差(RSD)，其結(jié)果見表3。由表2和3可以看出，各待測組分的R2＞0.99，同時各待測組分峰面積的RSD＜7%，說明該方法的線性關(guān)系良好，且適用于雌激素殘留的痕量檢測與定量分析。根據(jù)S/N=3求得3種雌激素的檢出限(LOD)，其結(jié)果見表3。

表2 3種雌激素的富集標準曲線方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 2 Enrichment standard curves，correlation coefficients and linear ranges of the three estrogens

表3 3種雌激素的富集倍數(shù)、方法的檢出限及相對標準偏差Table 3 Enrichment factors，LODs and RSDs of the three estrogens

2.3.3 富集倍數(shù)

合成材料對于3種待測雌激素的富集倍數(shù)即為富集標準曲線與直接進樣標準曲線斜率的比值［16］，其結(jié)果見表3。富集倍數(shù)(R)的計算公式為:R=K1/K2×1000，其中:K1為富集標準曲線的斜率，K2為直接進樣標準曲線的斜率。

2.4 實際樣品的測定

為了評價方法的適用性，以礦泉水和自來水作為樣品測定雌激素的殘留。經(jīng)檢測，所選擇的樣品中均未檢出雌激素殘留。為了進一步驗證所選擇樣品前處理方法的可行性，對樣品進行添加回收試驗。采用3個添加水平，每個水平重復(fù)測定3次，計算添加回收率，結(jié)果見表4?？梢钥闯觯V泉水和自來水中3種雌激素的添加回收率范圍分別為83.46%～99.43%與82.31%～98.54%，且RSD＜7.2%，可滿足水樣中雌激素殘留的痕量檢測需要。從圖3可以看出，樣品經(jīng)前處理富集，殘留雜質(zhì)的出峰時間在6 min之前，對于待測目標物的檢測沒有影響。

圖3 (a)空白礦泉水樣品和(b)加標(0.5 μg/L)礦泉水樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of(a)a blank sample and(b)the sample spiked with the estrogens at 0.5 μg/L

表4 不同加標水平下雌激素的回收率(n=3)Table 4 Recoveries of the estrogens spiked at three levels in the samples(n=3)

3 結(jié)論

本研究以溶膠凝膠技術(shù)合成的聚合物為固相萃取填充材料，建立了固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用在線富集測定水樣中3種雌激素殘留的痕量檢測方法，優(yōu)化了影響富集效果的若干因素。結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下，3種雌激素的檢出限、加標回收率及RSD均可滿足定量分析的需要。該方法簡便、高效、準確，適用于此類雌激素的殘留監(jiān)控。

［1］Ren Q L，Ma Q，Bai H J，et al.Journal of Henan Agricultural Sciences(任巧玲，馬強，白紅杰，等.河南農(nóng)業(yè)科學(xué))，2006(4):114

［2］Janowski T，Zdunczyk S，Malecki-Tepicht J，et al.Domest Anim Endocrin，2002，23(1/2):125

［3］Ganmaa D，Sato A.Med Hypotheses，2005，65:1028

［4］Farlow D W，Xu X，Veenstra T D，et al.J Chromatogr B，2009，877(13):1327

［5］Newmark H L，Heaney R P.Nutr Cancer，2010，62(3):297

［6］Parodi P W.Int Dairy J，2012，22(1):3

［7］Tang X S，Zhang Q X，Du X F，et al.Science and Technology of Food Industry(唐曉姝，張秋香，杜先鋒，等.食品工業(yè)科技)，2013，34(6):53

［8］Lü Y K，Yan X P.Chinese Journal of Analytical Chemistry(呂運開，嚴秀平.分析化學(xué))，2005，33(2):254

［9］Jiang X，Zhao C，Jiang N，et al.Food Chem，2008，108(3):1061

［10］Sadowski R，Gadzala-Kopciuch R.J Sep Sci，2013，36:2299

［11］Zhang Q，Liu Y.Modern Food Science and Technology(張群，劉燁.現(xiàn)代食品科學(xué))，2009，25(3):337

［12］Li X，Mou G Q，Chen L J，et al.Chinese Journal of Chromatography(李雪，牟光慶，陳歷俊，等.色譜)，2013，31(9):908

［13］Deng X L，F(xiàn)an J，Huang T H，et al.China Food(鄧曉麗，范軍，黃濤宏，等.中國食品)，2011(4):56

［14］Zhu Y L，Shao D S.Chinese Journal of Veterinary Drug(朱永林，邵德勝.中國獸藥雜志)，2006，40(11):5

［15］He J X，F(xiàn)ang G Z，Wang S.J Chromatogr A，2006，1127:12

［16］He J X，Wang S，F(xiàn)ang G Z.J Agric Food Chem，2008，56:2919