吳異蘭 鄭國(guó)華 龐書勤，李綿利，張琪

(福建中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院, 福建 福州 350122) (福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122) (福建中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院, 福建 福州 350122)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)，化學(xué)名稱為反式-3,4,5-三羥基-1,2-二苯乙烯(亦稱芪三酚)，是葡萄屬植物產(chǎn)生的一種植物抗毒素。白藜蘆醇的生物活性作用不但包括抗氧化、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂，而且還具有一定的抗腫瘤作用[1-4]。課題組對(duì)白藜蘆醇的前期體外研究發(fā)現(xiàn)其能夠抑制胃癌細(xì)胞株的增殖并誘導(dǎo)凋亡[5-6]；前期體內(nèi)研究通過對(duì)N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)等多因素染毒大鼠的死亡率、腫瘤發(fā)生率及胃體解剖組織學(xué)等指標(biāo)的觀察和分析，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還可有效提高大鼠對(duì)MNNG 等誘癌因素的耐受能力, 具有一定的預(yù)防作用[7]。在此基礎(chǔ)上，觀察白藜蘆醇預(yù)防性給藥對(duì)胃癌大鼠血清PG及相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響，探討其預(yù)防作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥品

雄性Wistar大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK滬2007-0005)的飼養(yǎng)在福建中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。白藜蘆醇購(gòu)自西安賽德公司(98%，HPLC)。MNNG(5g/瓶,日本TCI)實(shí)驗(yàn)前用甲醇助溶后用去離子水配成1g/L的儲(chǔ)備液(每周一配)，4℃冰箱保存并避光，每天臨用時(shí)稀釋為100mg/L。大鼠胃蛋白酶原(pepsinogens，PG)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D.

1.2 動(dòng)物分組、染毒及給藥方法

雄性Wistar大鼠95只，體質(zhì)量90～100g，4周齡。隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：其中模型組25只以MNNG染毒，具體染毒方法、動(dòng)物分組及給藥方法同文獻(xiàn)[7]；空白對(duì)照組10只普通飼料喂養(yǎng)；白藜蘆醇低劑量組(50mg/kg)、中劑量組(100mg/kg)和高劑量組(150mg/kg)各20只，染毒方法同模型組，選用在高鹽飼料基礎(chǔ)上加入不同劑量白藜蘆醇配成的低、中、高濃度白藜蘆醇飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。30周后模型組和白藜蘆醇各用藥組均改為空白對(duì)照組喂養(yǎng)方式至38周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 大鼠血清PG及TNF-α、HIF-1水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)大鼠血清PG及TNF-α、HIF-1水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前大鼠禁水12h、禁食24h。乙醚麻醉后剖腹，采腹動(dòng)脈血，離心取血清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔首先分別加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品(離心后的血清)，37℃反應(yīng)30min。棄去液體，充分洗滌5次后加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30min。棄去液體，充分洗滌5次后加入顯色液A、B，37℃顯色10min后加入終止液。15min內(nèi)在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm處測(cè)出OD值。所有OD值減除空白值后進(jìn)行計(jì)算，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品OD值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)每個(gè)待測(cè)樣本的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品PG及TNF-α、HIF-1濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析后用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清PG水平

ELISA檢測(cè)大鼠血清PG水平的結(jié)果見圖1。

圖1 ELISA檢測(cè)大鼠血清PG水平結(jié)果

2.2 各組大鼠血清TNF-α水平

ELISA檢測(cè)大鼠血清TNF-α水平的結(jié)果見圖2。

圖2 ELISA檢測(cè)大鼠血清TNF水平結(jié)果

2.3 各組大鼠血清HIF-1水平

ELISA檢測(cè)大鼠血清HIF-1水平的結(jié)果見圖3。

圖3 ELISA檢測(cè)大鼠血清HIF-1水平結(jié)果

3 討論

PG是胃蛋白酶的前體，分為PGI、PGⅡ兩個(gè)亞群。大部分酶原進(jìn)入胃腔，經(jīng)酸解成具有活性的胃蛋白酶發(fā)揮其消化蛋白質(zhì)的作用。但也有少量透過胃黏膜毛細(xì)血管進(jìn)入血液，故PG可從血清中檢測(cè)。血清PG水平是反映胃黏膜形態(tài)和功能的良好指標(biāo)。當(dāng)胃粘膜發(fā)生病變時(shí)，血清中PG的含量也隨之發(fā)生改變。PG作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于胃癌的早期診斷和篩選，以及胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的檢測(cè)都有重要的意義[8]。且幽門螺桿菌抗體與PG的濃度有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[9]。本研究中ELISA結(jié)果提示模型組大鼠血清PG值明顯低于空白對(duì)照組，而白藜蘆醇的預(yù)防用藥組的PG值與模型組相比有明顯增高，并有一定的濃度依賴性，提示了白藜蘆醇對(duì)胃部腫瘤的預(yù)防作用可能與其抗幽門螺桿菌的相關(guān)機(jī)制有所類似，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

TNF-α主要由活化的單核一巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、星型細(xì)胞、成骨細(xì)胞等亦可產(chǎn)生。本研究ELISA結(jié)果顯示，白藜蘆醇給藥組與模型組比較TNF-α值明顯上升，提示白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α抑制p38 MAPK、NF-ΚB這兩條炎癥通路達(dá)到抗炎效果[10]。

由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，腫瘤的部分細(xì)胞處于缺氧甚至無(wú)氧狀態(tài)。HIF-1在細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境的各條信號(hào)傳導(dǎo)通路中起到了核心作用，它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下的生長(zhǎng)、遷移。本實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇給藥組與模型組比較HIF-1值明顯下降，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，提示白藜蘆醇具有抑制HIF-1的作用，白藜蘆醇可能在HIF-1mRNA轉(zhuǎn)錄后通過各種信號(hào)通路增強(qiáng)其降解，阻礙其蛋白翻譯。另有研究表明白藜蘆醇可能通過對(duì)抗LPA(1ysophosphatidic acid)缺氧條件下引起的HIF-1和VEGF水平升高，從而抑制了LPA相關(guān)的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。自藜蘆醇還可能通過多種機(jī)制抑制乳腺癌細(xì)胞的糖代謝，這種抑制作用與HIF-1被抑制的表象一致[12]。這些結(jié)果提示我們可以考慮以HIF-1為靶點(diǎn)對(duì)白藜蘆醇對(duì)腫瘤的預(yù)防作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Guerrero RF, Garcia-Parrilla MC, Puertas B, et al. Wine, resveratrol and health:a review[J]. Nat Prod Commun，2009, 4(5):635-658.

[2]Boscolo P, Del Signore A, Sabbioni E, et al. Effects of resveratrol on lymphocyte proliferation and cytokine release[J]. Ann Clin Lab Sci, 2003, 33(2):226-231.

[3]Athar M, Back JH, Kopelovich L, et al. Multipe molecular targets of resveratrol:Anti-carcinogenic mechanisms[J]. Arch Biochem Biophys,2009, 486(2):95-102.

[4]Kundu JK, Surh YJ. Cancer chemopreventive and therapeutic potential of resveratrol:mechanistic perspectives[J]. Cancer Lett,2008, 269(2):243-261.

[5]鄭國(guó)華, 李會(huì)慶. 大蒜油和白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用及其機(jī)制[J]. 福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006, 16(6):34-36.

[6]鄭國(guó)華, 李顥, 李會(huì)慶. 大蒜油和白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生,2005, 2l(l0):1205-1207.

[7]鄭國(guó)華,諶海英,吳華嵩.白藜蘆醇對(duì)MNNG等多因素誘導(dǎo)大鼠胃部腫瘤的預(yù)防作用[J].中國(guó)自然醫(yī)學(xué)雜志,2010,12(5):321-323.

[8]金妮，沈銘昌. 胃蛋白酶原在胃癌及癌前病變組織中的表達(dá)[J].中華病理學(xué)雜志，1991,20(2):84-86.

[9]Kikuchi S, Kurosawa M, Sakiyama T, et al. Long-term effert of Helicobacter pylori infection on serum pepsinogens[J]. Jpn J Cancer Res, 2000,9(5):471-476.

[10]Manna SK, Mukhopadhyay A, Aggarwal BB1 Resveratrol suppress TNF-2 induced activation of unclear transcription factors NF-Κb, activator protein-1 and apoptosis:potential role of reactive oxygen intermediates and lipid peroxidation [J]. Immunol, 2001,164(11):6509.

[11]Park SY，Jeong KJ，Lee J，et al.Hypoxia enhances LPA-induced HIF-1alpha and VEGF expression: their inhibition by resveratrol[J].Cancer Lett，2007，258：63-69.

[12] Kueck A，Opipari AW，Gdth KA，et al.Resveratrol inhibits glucose metabolism in human ovarian cancer cells[J].Gynecol Onco，2007, 107：450-457.