吳小琴 楊 輝 魏宜勝 李愛群 鐘 赟 蘇 杭 丁元偉 林漫鵬

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科1(510260) 胃腸外科2 分子中心4 廣州心血管疾病研究所3

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一種嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已失去手術(shù)時機，因此尋找和研發(fā)新的抗HCC藥物具有重要臨床意義。芬維A胺(fenretinide)是人工合成的全反式維甲酸衍生物，可提高細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，其抗腫瘤活性已在眾多體內(nèi)外實驗和臨床化學(xué)預(yù)防試驗中得到驗證，抗腫瘤作用的發(fā)揮可能與誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)，ROS為參與介導(dǎo)該凋亡誘導(dǎo)過程的信號之一[1]。本課題組前期研究[2-5]發(fā)現(xiàn)芬維A胺能體外誘導(dǎo)某些人HCC細胞凋亡，其機制可能涉及維甲酸受體β(retinoic acid receptor beta, RARβ)激活、ERK1/2失活、核受體Nur77的出核和胞質(zhì)聚集等，但確切機制不明。本研究以對芬維A胺敏感的人HCC細胞株Huh-7為研究對象，通過觀察能清除ROS的抗氧化劑維生素E對芬維A胺效應(yīng)的影響，對ROS在芬維A胺誘導(dǎo)人HCC細胞凋亡中的作用及其可能機制作一探討。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人HCC細胞株Huh-7(中國科學(xué)院細胞庫)。芬維A胺( Sigma-Aldrich Co. LLC.)溶于DMSO原液并稀釋成10 mmol/L的儲存液，-20 ℃避光保存?zhèn)?用。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gibco?Cell Culture, Thermo Fisher Scientific Inc.)，Image-iTTMLIVE Green ROS檢測試劑盒(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)，CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞活力 檢測試劑盒、Caspase-Glo?3/7檢測試劑盒(Promega Corporation)，山羊血清(Abcam plc.)，Nur77兔多克隆抗體、GADD153兔多克隆抗體、GAPDH山羊多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnol-ogy, Inc.)。

二、實驗方法

1. 細胞培養(yǎng)和處理：Huh-7細胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清以及青霉素G 100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。實驗設(shè)維生素E處理組、芬維A胺處理組、維生素E+芬維A胺處理組和對照組。細胞處理時更換為無血清培養(yǎng)基，分別予維生素E(200 μmol/L)預(yù)處理2 h、芬維A胺(10 μmol/L)處理24 h或兩者聯(lián)合，對照組加入等體積DMSO(終濃度0.1%)。

2. 活細胞ROS檢測：細胞按組別予相應(yīng)處理后，細胞內(nèi)ROS以活細胞ROS熒光標記物羧基-H2DCFDA染色，胞核以核酸染料Hoechst 33342染色，HBSS沖洗3 min，Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡觀察。進一步以流式細胞術(shù)定量檢測ROS，按試劑盒說明書進行操作，以附CXP軟件的Beckman CytomicsTMFC 500 MPL流式細胞儀進行檢測、分析。

3. 細胞活力和凋亡檢測：細胞以1.5×104/孔接種于96孔板過夜，按組別予相應(yīng)處理后室溫平衡30 min，每孔加入100 μL CellTiter-Glo?試劑或等體積(1∶1)Caspase-Glo?3/7試劑，震蕩混勻，室溫孵育20～60 min，Promega ModulusTM微孔板光度計(P/N 9300-001)檢測。

4. Nur77表達和分布檢測：細胞按組別予相應(yīng)處理后，以新鮮配制的多聚甲醛溶液室溫固定15 min，含0.2% Triton X-100的PBS沖洗，置于含0.2% Triton X-100和5%山羊血清的PBS中室溫培養(yǎng)30 min，加入Nur77特異性抗體(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，含0.2% Triton X-100和1%山羊血清的PBS沖洗，加入FITC標記的二抗(1∶400)4 ℃ 過夜，PBS沖洗，含DAPI封固劑封固，共聚焦顯微鏡觀察。

5. GADD153蛋白表達檢測：細胞按組別予相應(yīng)處理后，以含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的NP-40裂解液裂解細胞，取50 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，膜置于含0.1% Tween 20和5%脫脂奶粉的PBS中室溫孵育1 h以阻止非特異性結(jié)合，加入一抗(GADD153 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)，于含5% PBST的牛奶中4 ℃過夜，1×TBST沖洗3次，將膜置于HRP標記的二抗工作液中室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑顯影，定影，SIM 凝膠成像分析系統(tǒng)BIO-PRO 200E觀察。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、維生素E阻斷芬維A胺誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生

共聚焦顯微鏡觀察顯示，芬維A胺處理能顯著誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，而維生素E預(yù)處理能顯著降低芬維A胺誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生(見圖1A)；進一步的流式細胞術(shù)定量檢測證實了芬維A胺誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和維生素E對芬維A胺效應(yīng)的消除作用(見圖1B)。上述結(jié)果表明維生素E預(yù)處理能充分阻斷芬維A胺誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。

A：共聚焦顯微鏡觀察，綠色熒光部分為ROS；B：流式細胞術(shù)定量檢測(縱坐標為細胞相對數(shù)，橫坐標為熒光強度，數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結(jié)果)

圖1維生素E預(yù)處理對芬維A胺誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的影響

二、維生素E降低芬維A胺的促人HCC細胞凋亡效應(yīng)

以活細胞內(nèi)ATP定量為基礎(chǔ)的細胞活力檢測顯示，與對照組相比，單純維生素E處理對Huh-7細胞生長無明顯影響，單純芬維A胺處理則能顯著抑制Huh-7細胞生長(P<0.01)；維生素E預(yù)處理能顯著降低芬維A胺對Huh-7細胞生長的抑制作用(P<0.05)，但與對照組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2A)。細胞凋亡檢測與細胞活力檢測結(jié)果一致，與對照組相比，單純維生素E處理對Huh-7細胞的凋亡蛋白Caspase 3/7活性無明顯影響，單純芬維A胺處理則能顯著提高Caspase 3/7活性(約為對照組的4～5倍，P<0.01)；維生素E預(yù)處理能顯著降低芬維A胺對Caspase 3/7活性的影響(P<0.05)，但仍約為對照組的3倍(P<0.05)(見圖2B)。上述結(jié)果證實芬維A胺能誘導(dǎo)人HCC細胞凋亡，而維生素E預(yù)處理能有效降低芬維A胺的促凋亡效應(yīng)。結(jié)合維生素E能阻斷芬維A胺誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，推測芬維A胺的促凋亡效應(yīng)至少部分是由ROS所介導(dǎo)。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；#兩組間比較，P<0.05(數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結(jié)果均值)

A：細胞活力檢測結(jié)果；B：Caspase 3/7活性檢測結(jié)果

圖2維生素E預(yù)處理對芬維A胺促人HCC細胞凋亡的影響

三、維生素E降低芬維A胺誘導(dǎo)的GADD153表達

為進一步研究芬維A胺-ROS誘導(dǎo)人HCC細胞凋亡的可能機制，研究檢測了維生素E對芬維A胺誘導(dǎo)Nur77、GADD153表達的影響。共聚焦顯微鏡觀察顯示，維生素E預(yù)處理對芬維A胺誘導(dǎo)的Nur77表達和出核無明顯影響(見圖3)；蛋白質(zhì)印跡

法檢測顯示，芬維A胺處理能顯著誘導(dǎo)GADD153表達，而維生素E預(yù)處理能顯著降低芬維A胺誘導(dǎo)的GADD153表達(見圖4)。上述結(jié)果表明芬維A胺-ROS誘導(dǎo)人HCC細胞凋亡的機制可能與促進GADD153表達有關(guān)。

圖4維生素E預(yù)處理對芬維A胺誘導(dǎo)GADD153表達的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

芬維A胺是一種全反式維甲酸衍生物，可作用于腫瘤細胞，通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力、提高細胞內(nèi)ROS水平而啟動一系列信號通路，抑制腫瘤細胞生長、增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。前期研究發(fā)現(xiàn)芬維A胺在體外能誘導(dǎo)Huh-7、Hep3B等人HCC細胞凋亡[2-5]，其促凋亡途徑包括誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生、激活RAR以及其他未知途徑[1]，但芬維A胺抗腫瘤作用的具體機制仍未完全闡明。

ROS是氧的不完全單電子還原形成的分子或離子，對維持體內(nèi)氧化與抗氧化平衡具有重要意義。在某些因素的作用下，ROS產(chǎn)生增多，引起氧化與抗氧化失衡，導(dǎo)致細胞凋亡[6]。因此，ROS在細胞凋亡的啟動和調(diào)節(jié)中扮演重要角色。其可增加脂質(zhì)過氧化和線粒體膜通透性，引起促凋亡因子釋放，激活凋亡蛋白Caspase-3，誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。在不同腫瘤細胞中，芬維A胺可能通過不同途徑誘導(dǎo) 線粒體產(chǎn)生ROS，經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[1,7-9]。

本研究觀察了抗氧化劑維生素E對芬維A胺在人HCC細胞Huh-7中誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS及其促凋亡效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)維生素E預(yù)處理能充分阻斷芬維A胺誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，并有效降低其促凋亡效應(yīng)，提示芬維A胺誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在人HCC細胞凋亡中起一定作用。

Nur77是孤兒核受體超家族的重要成員，可由多種生長因子或凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達，進而影響細胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡。前期研究[3]顯示芬維A胺可誘導(dǎo)Nur77表達和出核，此過程在芬維A胺誘導(dǎo)Huh-7細胞凋亡中起重要作用，Nur77的胞內(nèi)定位決定了人HCC細胞對芬維A胺誘導(dǎo)的細胞凋亡的敏感性。為進一步分析芬維A胺-ROS誘導(dǎo)人HCC細胞凋亡的可能機制，本研究采用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察了維生素E對芬維A胺誘導(dǎo)Nur77表達的影響，結(jié)果顯示維生素E預(yù)處理對芬維A胺誘導(dǎo)的Nur77表達和出核無明顯影響，表明芬維A胺-ROS的誘導(dǎo)凋亡作用與Nur77無關(guān)。

GADD153(又名CHOP)為一應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，屬于CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)家族成員，能以不依賴于p53的方式誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。研究[11-12]顯示GADD153參與了芬維A胺誘導(dǎo)的成神經(jīng)細胞瘤細胞凋亡。經(jīng)芬維A胺處理的腫瘤細胞，GADD153 mRNA和蛋白表達均上調(diào)；不論有無芬維A胺存在，過表達GADD153均能促進細胞凋亡，抑制GADD153表達則可消除芬維A胺的促凋亡效應(yīng)；芬維A胺誘導(dǎo)的GADD153表達不能被RARβ、RARγ拮抗劑阻斷，但可被抗氧化劑阻斷；過表達GADD153可增加腫瘤細胞對芬維A胺的敏感性。上述結(jié)果提示芬維A胺可通過RAR依賴性和非依賴性途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，其中RAR非依賴性途徑可能以ROS誘導(dǎo)GADD153表達為特征。本研究亦發(fā)現(xiàn)芬維A胺處理能顯著誘導(dǎo)GADD153表達，而抗氧化劑維生素E預(yù)處理能顯著降低芬維A胺誘導(dǎo)的GADD153表達，提示芬維A胺誘導(dǎo)GADD153表達與ROS有關(guān)。

綜上所述，本研究從體外細胞學(xué)角度發(fā)現(xiàn)維生素E可通過清除芬維A胺誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS抑制其促Huh-7細胞凋亡的效應(yīng)，提示ROS參與了芬維A胺誘導(dǎo)的人HCC細胞凋亡，其機制可能與誘導(dǎo)GADD153蛋白表達有關(guān)，上述發(fā)現(xiàn)為進一步探討芬維A胺對HCC的治療機制提供了新的線索。芬維A胺誘導(dǎo)Huh-7細胞產(chǎn)生ROS的機制以及芬維A胺-ROS-GADD153途徑誘導(dǎo)人HCC細胞凋亡的下游通路尚不清楚，有待進一步研究。

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