郝苗,金黎明,劉李娜,許永斌,馬堃,范圣第
(1.大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,遼寧大連 116021;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.海軍醫(yī)學(xué)研究所,上海 200443)
硒化枸杞多糖的制備及其抗氧化性研究
郝苗1,金黎明2,*,劉李娜3,許永斌2,馬堃2,范圣第2
(1.大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,遼寧大連 116021;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600;3.海軍醫(yī)學(xué)研究所,上海 200443)
摘 要:以亞硒酸鈉和枸杞多糖為原料合成硒化枸杞多糖,電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)定其中硒含量為64.42 mg/g。利用紫外-可見(jiàn)光譜、紅外光譜兩種表征手段,證實(shí)了硒化枸杞多糖的合成。采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法測(cè)定硒化枸杞多糖的抗氧化能力,結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度范圍內(nèi),硒化枸杞多糖的抗氧化能力隨著濃度的增加而增加,且高于枸杞多糖。2.0 mg/mL的枸杞多糖和硒化枸杞多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為51.48%和59.34%,對(duì)羥自由基的清除率分別為50.23%和56.16%。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究硒化枸杞多糖作為抗氧化能力較強(qiáng)的食品和藥品的可能性奠定了基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:硒化枸杞多糖;合成;表征;電感耦合等離子體質(zhì)譜;抗氧化性
枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材,素有“紅寶”美稱, 富含植物多糖、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP) 是枸杞主要的有效成分之一,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能、減少體內(nèi)脂肪含量、抗腫瘤、抗衰老等多種生理功能[1]。
硒(selenium)是人體所必需的微量元素之一,具有抗氧化、抗癌、延緩衰老、增強(qiáng)人體免疫力等功效。但大多數(shù)無(wú)機(jī)硒化合物毒性較大,應(yīng)用受到了限制。硒多糖作為一種有機(jī)硒化合物,使用安全且兼有硒與多糖二者的活性,更加易于機(jī)體吸收和利用[2]。目前已有許多研究證明,硒多糖具有抗氧化、抗金屬中毒、抗癌細(xì)胞和病毒等多種作用[3-4]。
某些動(dòng)植物和微生物體內(nèi)含有天然硒多糖,但含量很少,使硒多糖的研究受到了一定限制。近年來(lái),研究者嘗試使用人工方法獲得硒多糖,如在合適的培養(yǎng)條件下把無(wú)機(jī)硒添加到藻類、真菌等培養(yǎng)基中,通過(guò)生物體自身富集和轉(zhuǎn)化來(lái)獲得硒多糖[5-6]。或者利用化學(xué)合成方法獲得硒多糖,如硒化角叉菜膠[7]、硒化紅薯葉多糖[8]、硒化白沙蒿多糖[9]、硒化羧甲基殼聚糖[10]等。
本實(shí)驗(yàn)以亞硒酸鈉和枸杞多糖為原料合成硒化枸杞多糖(selenium-Lycium barbarum polysaccharide,SeLBP),利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測(cè)定其中硒含量,利用紫外-可見(jiàn)光譜、紅外光譜兩種方法對(duì)其進(jìn)行表征,并采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SeLBP的抗氧化能力。
1.1.1 試劑
枸杞提取物,西安天一生物技術(shù)有限公司。抗壞血酸(VC),亞硒酸鈉,無(wú)水乙醇,冰乙酸,鹽酸,硝酸,甲苯,濃硝酸,雙氧水,鄰苯三酚,鄰二氮菲等,均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
1.1.2 儀器
Lambda25型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):美國(guó)PE公司;370DTGS型紅外光譜儀:美國(guó)Thermo公司;7700X Series型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀:美國(guó)Agilent公司;DF-101S型恒溫磁力攪拌器:鞏義市英峪于華儀器廠;DHG-9070A型真空干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SevenEasy型pH計(jì):上海梅特勒-托利多儀器有限公司。
1.2.1 枸杞多糖的純化
稱取適量枸杞多糖提取物,用2倍體積的乙酸乙酯脫脂,充分搖勻靜置后,取濾渣。加入適量蒸餾水將干燥后的濾渣溶解,加入25%體積的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇∶氯仿=1∶4),劇烈振蕩20min。4000r/min離心10 min,傾出上清液,除去中間層變性蛋白和下層氯仿。重復(fù)以上操作,直至中間層無(wú)變性蛋白。
向上清液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇,冰箱冷藏過(guò)夜,得到多糖沉淀,冷凍干燥得到純化的LBP。
1.2.2 枸杞多糖中多糖含量測(cè)定
用苯酚-硫酸法測(cè)定LBP中多糖含量[11]。
1.2.3 硒化枸杞多糖的制備
參考梁淑軒等[12]的方法,稱取1 g純化后的LBP溶解于25 mL超純水中,磁力攪拌溶解后加入1 mL冰醋酸。取1 g亞硒酸鈉溶于少量超純水,緩慢加入LBP溶液中,磁力攪拌器上50℃下反應(yīng)48 h。加入3倍體積無(wú)水乙醇,使其沉淀完全。離心得到沉淀后用無(wú)水乙醇洗滌3次,加入少量的超純水溶解,用超純水透析24 h,未透液經(jīng)冷凍干燥得到SeLBP。
1.2.4 紫外光譜法測(cè)定
將LBP和SeLBP用去離子水配成0.5 mg/mL的溶液,用去離子水為參比,進(jìn)行紫外光譜測(cè)定,波長(zhǎng)掃描范圍為190 nm~400 nm。
1.2.5 紅外光譜法測(cè)定
將少量的LBP和SeLBP用KBr壓片,進(jìn)行紅外吸收光譜測(cè)定,測(cè)定范圍為400 cm-1~4 000 cm-1。
1.2.6 電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測(cè)定硒含量
準(zhǔn)確稱取適量SeLBP于干燥的聚四氟乙烯消解罐內(nèi),加入4 mL硝酸,1 mL H2O2搖勻,密封,置入微波消解系統(tǒng)中進(jìn)行消解,消解完全后,用少量超純水洗罐3次~4次,定容。上ICP-MS測(cè)定,樣品定量分析采用外標(biāo)法,內(nèi)標(biāo)元素選用89Y。做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),得出平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其中硒含量。
1.2.7 抗氧化能力測(cè)定
采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定LBP和SeLBP清除超氧陰離子自由基的能力,并以VC為對(duì)照實(shí)驗(yàn)[13]。
采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測(cè)定LBP和SeLBP清除羥自由基的能力,并以VC為對(duì)照實(shí)驗(yàn)[13]。
根據(jù)圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得出純化后的LBP中多糖百分含量為66.44%。
圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose
得到的SeLBP為深黃色固體,產(chǎn)率為56.81%。經(jīng)ICP-MS測(cè)定其中硒含量為64.42 mg/g。
目前化學(xué)法合成硒化多糖常用SeOCl2、亞硒酸、亞硒酸鈉等作為硒化試劑。Junlong Wang等[9]用H2SeO3/HNO3和BaCl2做催化劑,合成了硒化白沙蒿多糖,發(fā)現(xiàn)強(qiáng)酸會(huì)使多糖降解。本實(shí)驗(yàn)參考了梁淑軒等[12]的方法,以醋酸做為催化劑,反應(yīng)條件為50℃,反應(yīng)48 h。制備得到的SeLBP中硒含量為64.42mg/g,顯著高于一些文獻(xiàn)報(bào)道,如合成的硒化紅薯葉多糖中硒含量為 358 μg/g[8]、硒化白沙蒿多糖中硒含量為 1 703 μg/g[9]、硒化羧甲基殼聚糖中硒含量為20.50 mg/g[10]。
LBP紫外光譜見(jiàn)圖2。
圖2 枸杞多糖和硒化枸杞多糖的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV spectrum of LBP and SeLBP
從圖2中可以看出,LBP經(jīng)硒化后,最大吸收峰從281 nm轉(zhuǎn)移到275 nm,峰值的變化表明了LBP中成功引入了亞硒酸根。
LBP和SeLBP的紅外光譜見(jiàn)圖3。
圖3 枸杞多糖和硒化枸杞多糖的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of LBP and SeLBP
由圖3可知,LBP經(jīng)硒化后的紅外圖譜變化不大,說(shuō)明多糖的結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有改變。硒化后,在795 cm-1處出現(xiàn)有亞硒酸酯的特征吸收峰。LBP的C6-OH的伸縮振動(dòng)峰由1 026 cm-1紅移至1 031 cm-1,說(shuō)明C6上的-OH可能參與了硒化反應(yīng)。
LBP和SeLBP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 枸杞多糖和硒化枸杞多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率曲線Fig.4 Curves of scavenging effect on superoxide radicals of LBP and SeLBP
從圖4可以看出,LBP和SeLBP對(duì)超氧陰離子自由基均有不同程度的清除作用,隨著濃度的增加而增強(qiáng),且SeLBP的清除作用強(qiáng)于LBP。濃度為2.0 mg/mL的LBP和SeLBP對(duì)超氧陰離子的清除率分別為51.48%和59.34%,高于2.0 mg/mL的VC。
LBP和SeLBP對(duì)羥自由基的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖5。
圖5 枸杞多糖和硒化枸杞多糖對(duì)羥自由基的清除率曲線Fig.5 Curves of scavenging effect on hydroxyl radicals of LBP and SeLBP
從圖5可以看出,LBP和SeLBP對(duì)·OH都具有一定的清除作用,呈濃度依賴關(guān)系,且SeLBP的清除能力更強(qiáng)。以濃度為2.0 mg/mL的LBP和SeLBP為例,對(duì)·OH的清除率分別為50.23%和56.16%,接近于2.0 mg/mL 的 VC。
本實(shí)驗(yàn)以亞硒酸鈉和LBP為原料合成SeLBP,ICP-MS測(cè)定其中硒含量為64.42 mg/g。利用紫外-可見(jiàn)光譜、紅外光譜兩種表征手段,證實(shí)了SeLBP的合成,硒化反應(yīng)主要通過(guò)C6上的-OH完成。SeLBP的抗氧化能力呈濃度依賴關(guān)系,且由于引入了硒這種具有抗氧化能力的元素,在同樣濃度條件下的抗氧化能力要高于LBP。2.0 mg/mL的LBP和SeLBP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為51.48%和59.34%,對(duì)羥自由基的清除率分別為50.23%和56.16%。本實(shí)驗(yàn)合成的SeLBP既具有抗氧化能力,又有補(bǔ)硒作用,是一種較為理想的有機(jī)補(bǔ)硒產(chǎn)品。
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Synthesis and Antioxidant Activity of Selenium-Lycium Barbarum Polysaccharide
HAO Miao1,JIN Li-ming2,*,LIU Li-na3,XU Yong-bin2,MA Kun2,F(xiàn)AN Sheng-di2
(1.Dalian Institute of Product Quality Supervision and Inspection,Dalian 116021,Liaoning,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,Liaoning,China;3.Naval Medical Research Institute,Shanghai 200443,China)
Abstract:Sodium selenite and Lycium barbarum polysaccharide (LBP) were used to synthesize selenium-Lycium barbarum polysaccharide (SeLBP)in this experiment by chemical method.The content of selenium was determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS)and the result was 64.42 mg/g.SeLBP was characterized by visible ultraviolet (UV-VIS) and infrared (IR) techniques.The results proved the successful synthesis of SeLBP.The antioxidant activities in vitro of SeLBP was investigated by phenanthroline-Fe2+andpyrogallolautoxidationmethod.The resultsshowedthatinthe setting concentrationrange,the antioxidant activities increased with the elevation of concentration.The antioxidant activities of SeLBP were better than that of LBP.The clearance rates on superoxide anion radical of 2.0 mg/mL LBP and SeLBP were 51.48%and 59.34%,respectively.The scavenging rates on hydroxyl radical of 2.0 mg/mL LBP and SeLBP were 50.23%and 56.16%,respectively.This research was an important step as means of laying the foundation for further research on SeLBP as a low toxicity and effective organic selenium product.
Key words:selenium-Lycium barbarum polysaccharide (SeLBP); synthesis; characterization; inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS);antioxidant activity
DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.004
國(guó)家自然科學(xué)基金(21172028);遼寧省教育廳項(xiàng)目(L2013510);中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(DC110318);海軍醫(yī)學(xué)研究所基金(12HY03)
郝苗(1976—),女(漢),高級(jí)工程師,碩士,研究方向:食品分析。
金黎明(1979—),女(朝鮮),副教授,博士,研究方向:生物活性物質(zhì)。
2013-08-13