張駿，王碩，張燕，何佳，林安清

（1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，天津 300100；3.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300461）

豬肉中多種獸藥殘留液質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)的研究

張駿1，2，王碩1，張燕1，何佳3，林安清3

（1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，天津 300100；3.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300461）

摘 要：建立了可同時檢測豬肉中氯丙嗪，丙酰丙嗪，氮哌酮，氟哌啶醇，氮哌醇，咔唑心安多種獸藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，在已有的研究基礎(chǔ)上對樣品的前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，檢出限均為0.5μg/kg，平均加標(biāo)回收率在77.2%～100.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在4.7%～10.1%之間。該方法簡單快速，回收率高，重現(xiàn)性好，方法回收率和精密度滿足殘留分析規(guī)定指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：豬肉；獸藥；質(zhì)譜；檢測

近年來，豬肉——這種人們較常食用的動物源性食品相繼發(fā)生了一系列質(zhì)量安全問題，如“雙匯瘦肉精”事件，引起了全社會的廣泛關(guān)注。我國每年肉類總產(chǎn)量為七千多萬噸，其中豬肉為近5 000萬t，幾乎占肉類產(chǎn)品總產(chǎn)量的三分之二。因此，保證豬肉質(zhì)量，尤其是加強(qiáng)對其中獸藥殘留檢測至關(guān)重要。獸藥殘留問題關(guān)系到千家萬戶，甚至影響到國計民生和社會穩(wěn)定，除了較為人所熟知的“瘦肉精”（主要包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等）外，還有其它一些獸藥也較常在豬等家畜身上使用，同樣應(yīng)引起足夠重視[1-2]。

鎮(zhèn)靜藥和beta-受體阻滯藥咔唑心安（卡拉洛爾）常用于消除動物的緊張，抑制動物運(yùn)動，降低消耗促長膘。特別是在轉(zhuǎn)運(yùn)至屠宰場的過程中使用可降低動物的維持需要和減少途中失重，死亡率。從用藥到屠宰一般不超過幾小時，這就可能導(dǎo)致在可食部分有這類藥物高殘留量，食用殘留鎮(zhèn)靜藥物的動物組織將有害人體健康，尤其會影響兒童大腦發(fā)育[3]。鎮(zhèn)靜劑類藥物具有抑制腦干及大腦皮質(zhì)，產(chǎn)生安靜和減低運(yùn)動性作用；與麻醉性止痛劑并用，具有神經(jīng)性安定鎮(zhèn)痛作用，但同時也有一定的副作用。吩噻嗪類鎮(zhèn)靜藥物氯丙嗪、乙酰丙嗪和丙酰丙嗪由于具有過敏毒性及易產(chǎn)生阻滯型黃疸和多種皮膚病反應(yīng)，已被歐盟禁止用于食用性動物[4]，我國也已將氯丙嗪列入食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單，在所有動物源性食品中不得檢出該類藥物，因此加強(qiáng)對動物性食品中這類藥物的檢測具有重要意義。常用鎮(zhèn)定藥有氯丙嗪（Chlorpromazine）、乙酰丙嗪（Acepromazine）、丙酰丙嗪（Propionylpromazine）、甲苯噻嗪（Xylazine）、地西泮（Diazepam）、氮哌酮（Azaperone）及其代謝物氮哌醇（Azaperol），beta-受體阻滯藥為咔唑心安（Carazolol）。

目前對動物性食品中鎮(zhèn)靜藥和咔唑心安的檢測方法國內(nèi)主要是紫外分光光度法、薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-原子發(fā)射光譜聯(lián)用法，氣/質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS），流動注射分光光度法[5-6]，但多為藥物純品分析或人體中血漿、血清、尿樣中鎮(zhèn)靜藥物分析，而且檢測低限難以達(dá)到對歐美出口食品要求。目前尚未見動物組織如肉、肝、腎中鎮(zhèn)靜藥和咔唑心安的檢測方法報道。發(fā)達(dá)國家對上述藥物開展的殘留分析研究已有多年，近年來應(yīng)用氣/質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）技術(shù)檢測動物源食品中鎮(zhèn)靜藥和咔唑心安取得了進(jìn)展[7]，但GC-MS方法大多需要衍生化[8]。歐盟官方確證方法（HPLC和TLC）檢測步驟比較煩瑣，不能一次檢測，且都不能用于確證，回收率也較低。歐盟GC-MS確證方法中，甲苯噻嗪（Xylazine）、氮哌醇（Azaperol）、咔唑心安的離子再現(xiàn)性不好，不能用于準(zhǔn)確確證。LC-MS/MS法具有較好的靈敏度及高分離鑒別性能，且不需進(jìn)行衍生化操作，可提高分析效率和定量重現(xiàn)性，是近年來國外對動物源食品中多種鎮(zhèn)靜藥同時檢測較先進(jìn)的技術(shù)模式[9-10]。

表1 目標(biāo)物化學(xué)信息一覽表Table 1 Chemical information of target veterinary drugs

我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定氯丙嗪允許使用，但動物組織中不得檢出。本研究旨在建立豬肉中多種獸藥殘留系統(tǒng)分析檢測方法，從而進(jìn)一步提升豬肉及其制品質(zhì)量安全檢測水平。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

1.1.1 材料

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1100-API 4000（Agilent公司-AB公司，美國），配有電噴霧電離源和大氣壓化學(xué)電離源，并具有正-負(fù)電離方式自動切換功能。高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速大于10 000 r/min，T25（IKA公司，德國）。氮?dú)獯蹈蓛x：N-EVAP112（OA公司，美國）。渦旋振蕩器：231（Fisher Scientific公司，美國）。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速大于3 000 r/min（北京醫(yī)療器械廠，中國）。濾膜：孔徑0.22 μm，有機(jī)相。

1.1.2 試劑和材料

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，叔丁基甲醚、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀均為分析純，鹽酸為優(yōu)級純。0.1%甲酸水溶液：取1 mL甲酸溶解于1 000 mL水中。5 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取50.0 g氫氧化鈉，用水溶解，定容到250 mL。1 mol/L磷酸二氫鉀溶液：pH=3，稱取68.045 g磷酸二氫鉀用水溶解，用鹽酸將溶液的pH調(diào)至3.0，定容到500 mL。定容液：0.1%甲酸水溶液：乙腈（8∶2）。標(biāo)準(zhǔn)品：氯丙嗪、氮哌酮、氟哌啶醇、氮哌醇、咔唑心安純度為99%；丙酰丙嗪純度為98%。

氯丙嗪、氮哌酮、氟哌啶醇、丙酰丙嗪、咔唑心安標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（0.10 mg/mL）：稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇配成0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在2℃～4℃條件下避光儲存。氮哌醇標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1.0 μg/mL）：準(zhǔn)確移取1.0 mL氮哌醇標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，配成1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在2℃～4℃條件下避光儲存。

吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用乙腈配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，在2℃～4℃條件下避光儲存。

根據(jù)每種鎮(zhèn)定劑及其代謝物的靈敏度和儀器線性范圍用空白樣品提取液配成不同濃度（ng/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在2℃～4℃條件下避光儲存。

基質(zhì)提取液：空白樣品，操作同上述處理后得到的溶液?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液混合后在氮吹儀中吹干，以基質(zhì)提取液溶解，渦旋30 s后即為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.1.3 樣品

實(shí)驗(yàn)所用豬肉購自本地超市。

1.2 方法

1.2.1 提取和凈化

稱取試樣2.00 g（精確到0.01 g）放入50 mL聚丙烯離心管中，加入3 mL 5 mol/L氫氧化鈉溶液，并進(jìn)行渦流混合30 s。在（80±5）℃水浴中放置1 h。在此期間，要對每個測定樣品進(jìn)行兩次渦流混合。1 h后，將樣品從水浴中取出并冷卻至室溫。加入12 mL叔丁基甲醚，置于振蕩器上高速振蕩15 min，離心15 min（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）。吸出上清液，將叔丁基甲醚轉(zhuǎn)移到干凈的15 mL的離心管內(nèi)，待凈化。

在上述15mL離心管中加入1mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH=3）3 mL，振蕩 10 min，離心 10 min（4 000 r/min）。將特丁基甲醚層吸出棄去。然后再在磷酸鹽緩沖溶液中加入2 mL叔丁基甲醚重復(fù)上述步驟。加入1 mL 5 mol/L氫氧化鈉溶液搖勻后加入10 mL叔丁基甲醚，振蕩15 min，離心5 min（4 000 r/min）。定量吸取叔丁基甲醚轉(zhuǎn)移到一個干凈的10 mL的離心管中。在40℃條件下用氮吹儀蒸發(fā)至干。在濃縮至干的提取物中加入1 000 μL定容液，進(jìn)行渦流混合，超聲處理10 min。用0.2 μm×13 mm的聚四氟乙烯注射式過濾器過濾樣液，將樣液轉(zhuǎn)移到試樣瓶中，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.2 測定條件

1.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Allure C18，5 μm，150 mm×2.1mm，3 μm（Waters公司，美國）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.3 mL/min。流動相及梯度變化情況見表2。

表2 流動相組成與梯度變化表Table 2 Linear gradient elution conditions

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：600 ℃；霧化氣壓力：12 psi；氣簾氣壓力：25 psi；輔助氣1壓力：40psi；輔助氣 2壓力：40psi；電噴霧電壓：5500V；監(jiān)測離子對、去簇電壓、入口電壓、碰撞能量和碰撞室出口電壓見表3。

表3 目標(biāo)物質(zhì)譜檢測參數(shù)一覽表Table 3 MS/MS parameters of target compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化

吩噻嗪類化合物為堿性化合物，在堿性條件下，化合物呈分子形態(tài)，易被有機(jī)相提取。根據(jù)文獻(xiàn)和事跡測定結(jié)果，在pH＞10.5時能夠?qū)㈡?zhèn)靜藥完全提取到有機(jī)溶劑中。有機(jī)溶劑的使用文獻(xiàn)報道有乙腈、乙醚、叔丁基甲醚等，比較之下，叔丁基甲醚的提取效率較高。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

LC－MS/MS具有較高的檢測靈敏度，但“臟”的基質(zhì)背景不僅會抑制目標(biāo)化合物的離子化效率，大大降低對被測組分的檢測靈敏度，而且樣品凈化不好還會對結(jié)果重現(xiàn)性產(chǎn)生很大的影響。根據(jù)文獻(xiàn)，主要對比了液液分配和固相萃取兩種凈化方法。液液分配方法主要利用吩噻嗪類的堿性特征，在堿性條件下提取至有機(jī)相，再將體系調(diào)整為酸性，使被測物成水溶性，此時有機(jī)相可用于除去雜質(zhì)，最后再回調(diào)堿性將被測物溶于有機(jī)相，吹干定容。實(shí)驗(yàn)證明，這種利用酸堿性改變被測物溶解性來凈化的方法效果較好。而文獻(xiàn)中報道的固相萃取方法通常用乙腈提取，溶液過C18柱凈化，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種方法凈化效果也較好，只是氟哌啶醇回收率較低，不能滿足同時檢測的需要。因此確定采用液液分配方法進(jìn)行凈化。我們還嘗試用0.1%甲酸作為水相，凈化后不再轉(zhuǎn)移至有機(jī)相，直接進(jìn)樣，但發(fā)現(xiàn)樣品凈化效果較差，因此最終選擇調(diào)酸水溶再調(diào)堿脂溶兩步分配的方法。這種方法凈化步驟較簡單，而且叔丁基甲醚溶液較易吹干。

2.2 HPLC操作條件的選擇與優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

吩噻嗪類化合物為堿性化合物，流動相的離子強(qiáng)度和pH對其在C18柱上的分離和保留具有顯著影響，適當(dāng)?shù)膒H和離子強(qiáng)度可抑制色譜柱中殘存硅醇基的解離和保證吩噻嗪類化合物在流動相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)。本方法采用0.1%甲酸水溶液（pH 3.0）和乙腈作為流動相，通過優(yōu)化試驗(yàn)，采用梯度洗脫方式可實(shí)現(xiàn)吩噻嗪類化合物的快速有效分離。最終樣品定容液應(yīng)選擇流動相，而用乙腈或甲醇對峰形及保留時間均有影響。

2.2.2 液相色譜柱的選擇

文獻(xiàn)報道，因吩噻嗪類化合物的胺基能在水中發(fā)生解離，色譜柱固定相表面的殘存硅醇基和金屬離子可通過氫鍵或離子交換作用強(qiáng)烈吸附吩噻嗪類化合物，會出現(xiàn)色譜峰拖尾、保留時間不穩(wěn)定或過長，甚至被保留在色譜柱上的現(xiàn)象，導(dǎo)致峰形異常和分離度下降。因此需要選用以高純硅膠為基體并經(jīng)端基封閉處理的C18柱、C8柱、苯基柱或非硅膠基的聚合物反相固定相作為分離柱。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在等流速、等比例條件下進(jìn)行LC－MS/MS分析時，以高純硅膠為基體的C18柱對各種鎮(zhèn)靜藥的分離和柱效更好一些。該柱對吩噻嗪類化合物具有良好的分離效果和對稱的峰形，可滿足質(zhì)譜檢測的要求。

2.2.3 進(jìn)樣量

在達(dá)到檢出限的前提下，進(jìn)樣量越少，色譜峰形對稱性越好，定量就越準(zhǔn)確。最終確定進(jìn)樣量為10 μL，既滿足檢測限的要求，且質(zhì)量色譜峰峰形又好。

2.3 MS操作條件的選擇與優(yōu)化

2.3.1 MS的優(yōu)化

將被測化合物用甲醇分別配成濃度為1 μg/mL的工作液，用蠕動泵，以ESI+方式電離首先優(yōu)化第一級質(zhì)譜Q1 MS，根據(jù)ESI+方式電離得到較強(qiáng)的信號響應(yīng)值，確定電離正負(fù)方式和準(zhǔn)分子離子（M+1）即母離子峰值，并優(yōu)化去簇電壓（DP）和入口電壓（EP）。

2.3.2 MS/MS的優(yōu)化和子離子的選擇

母離子確定后進(jìn)行第二級質(zhì)譜MS2優(yōu)化，根據(jù)所獲得的各激素二級質(zhì)譜圖，選擇子離子。子離子的選擇通常按如下幾個原則：

1）質(zhì)荷比m/z大于100，而且盡可能的大；

2）離子強(qiáng)度盡可能的強(qiáng)；

3）子離子優(yōu)化時應(yīng)適當(dāng)多選1個～2個，以便在后期的實(shí)驗(yàn)中若有本底與所選子離子的m/z值相同而干擾其測定時舍去。

子離子確定之后，優(yōu)化離子碰撞電離能（CE）和出口電壓（CXP）。

2.4 方法的線性范圍

配制5種鎮(zhèn)靜藥及代謝物及咔唑心安的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以本方法的測試條件，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，用峰面積對標(biāo)準(zhǔn)溶液中各被測組分的濃度做圖，其各目標(biāo)物在檢測范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系，線性方程和相關(guān)系數(shù)見表4。

圖1 樣品添加回收的質(zhì)量色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of blank pork spiked with target veterinary drugs

表4 線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear equations and related coefficient

2.5 方法檢測限

根據(jù)實(shí)際添加試驗(yàn)，鎮(zhèn)靜藥檢測方法檢測限為0.5 μg/kg?？瞻棕i肉基質(zhì)添加0.5 μg/kg鎮(zhèn)靜藥及咔唑心安所做回收的質(zhì)量色譜圖見圖1。

2.6 方法的回收率

本研究以不含被測鎮(zhèn)靜藥的空白豬肉為基質(zhì)，作了 0.5、1.0、5.0 μg/kg 3 個水平添加回收率實(shí)驗(yàn)，所測5種鎮(zhèn)靜藥及代謝物和咔唑心安的室間平均回收率在77.2%～100.3%之間。

2.7 方法的精密度

采用空白豬肉基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行重復(fù)性測定，每個水平為10個樣品，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在4.7%～10.4%，符合農(nóng)獸藥殘檢測要求。

3 結(jié)論

建立了可同時檢測豬肉中氯丙嗪，丙酰丙嗪，氮哌酮，氟哌啶醇，氮哌醇和咔唑心安多殘留的LC-MS/MS方法。在已有的研究基礎(chǔ)上對樣品的前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)。該方法簡單快速，回收率高，重現(xiàn)性好，適用于豬肉及豬肉制品中多種獸藥殘留的定量檢測，方法檢出限滿足國內(nèi)外殘留限量要求。

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[1]Rokka M,Pe ltonen K.Food Add it Con tam,2006,23(5):470

[2]Canadian Food Inspection Agency Saskatoon Laboratory.AERSP11[S].2005

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[4]Anton F Erasmuson,Bryan G Scahill,David M West.Natural Zeranol in the Urine of Pasture-Fed Ainmals[J].J Agric Food Chem.,1994,42(11):2721-2725

[5]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局進(jìn)出口食品安全局,動植物檢疫監(jiān)管司,國際合作(科技)司,中國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所.動物和動物源食品中獸藥殘留物分析方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2003:140-150

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[7]蔣宏建,俞克佳,譯.電噴霧質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)[M].1版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:4-34

[8]Daniela Daniel,Ivano G R Gutz.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2005,37(2):281-286

[9]Philippe Delahaut,Pierre-Yves Brasseur,Michel Dubois Journal of Chromatography A,2004,1054(3):373-378

[10]The council of the european union.council directive 2002/657/EC[S].2002

Determination of Residues of Veterinary Drug in Pork by LC-MS/MS

ZHANG Jun1，2，WANG Shuo1，ZHANG Yan1，HE Jia3，LIN An-qing3
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Bureau Quality and Technical Supervision，Tianjin 300100，China；3.Tianjin Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：A liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method for the determination of some residues of veterinary drug （chlorpromazine，azaperone，propionylpromazine，haloperidol，azaperol and carazolol）in pork was developed.The research optimized and improved the sample pretreatment on the basis of existing study.All of the limits of detection （LODs） of these veterinary drug were 0.5 μg/kg.The average recoveries of target drugs ranged from 77.2%－100.3%with relative standard deviations（RSDs） of 4.7%－10.1%.The developed method is the suitable method for the rapid quantitative and reliable determination of veterinary drug residues.The results demonstrated that the sensitivity，accuracy and precision of this method meet the requirements of residue analysis.The method is applicable to detect these residues of veterinary drug in pork.

Key words：pork；veterinary drug；LC-MS/MS； determination

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.020

863計劃（No 2011AA100806）；國家質(zhì)檢總局重點(diǎn)科研項(xiàng)目（No 2007IK131）

張駿（1982—），男（漢），工程師，博士研究生，主要從事食品安全檢測研究。

2012-10-26