柏婷 ，伊奧爾 ，湯建國(guó) ，祝琳華 ，喬丹娜 ，孟昭宇

（1.昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，昆明 650500； 2.紅塔煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南玉溪 653100）

果膠是煙草重要組成部分，其基本結(jié)構(gòu)是半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸［1］。煙草中果膠含量過(guò)高會(huì)使煙草燃燒不完全而產(chǎn)生甲醇，甲醇進(jìn)一步氧化成甲醛、甲酸等，對(duì)煙草吸味及安全性產(chǎn)生不利影響［2］，果膠含量已成為評(píng)價(jià)煙草及煙草制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，因此準(zhǔn)確測(cè)定煙草中果膠含量對(duì)煙草品質(zhì)監(jiān)控有重要意義［3–4］。

目前果膠測(cè)定方法主要有重量法［5］、咔唑比色法［6］、3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［7］、高效液相色譜（HPLC）法［8］、流動(dòng)分析法［9］、氣相色譜（GC）法［10］及離子色譜法［11–12］。重量法操作復(fù)雜，測(cè)量結(jié)果不穩(wěn)定；咔唑比色法和高效液相色譜法利用酸把果膠酸解成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸遇酸易形成內(nèi)酯，會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低；氣相色譜法需衍生化，操作復(fù)雜；3，5-二硝基水楊酸法和流動(dòng)分析法利用果膠酶把果膠分解成半乳糖醛酸，3，5-二硝基水楊酸法測(cè)量精度不夠，流動(dòng)分析法穩(wěn)定性不好、試劑用量大。YC/T 346–2010［12］方法選擇性和靈敏度高，但前處理過(guò)程復(fù)雜，僅除糖和酸化過(guò)程就需2次回流、2次過(guò)濾、6次洗滌，處理時(shí)間約3 h。

筆者采用酸醇溶液加熱回流同時(shí)除糖和酸化，利用果膠酶對(duì)除糖酸化液和濾渣分別進(jìn)行酶解，然后采用離子色譜測(cè)定合并酶解液中半乳糖醛酸含量，建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定煙草中果膠含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS–3000型，附安培檢測(cè)器、AS自動(dòng)進(jìn)樣器，Chromeleon 6.8色譜工作站，安培檢測(cè)器用金工作電極，pH/Ag/AgCl參比電極，鈦對(duì)電極，美國(guó)Dionex公司；

超純水儀：Millipore型，美國(guó)Millipore公司；

電子天平：PG503–S型，感量為 0.1 mg，瑞士Mettler公司；

旋風(fēng)研磨儀：CyclotecTM1093型，美國(guó)FOSS公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH–2型，金壇市富華儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：FED115型，德國(guó)賓德公司；

半乳糖醛酸：美國(guó)Fluka公司；

果膠酶溶液：10 000 U/mL，諾維信公司；

果膠、無(wú)水乙酸鈉、50%氫氧化鈉溶液：美國(guó)Sigma公司；

無(wú)水乙醇、乙酸、鹽酸：分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

煙草樣品：紅塔集團(tuán)；

實(shí)驗(yàn)用水為二次石英蒸餾水，并經(jīng)Millipore超純水儀處理（電阻率≥18.2 MΩ·cm），0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.2 樣品前處理

按照 YC/T 31–1996［13］規(guī)定處理樣品及測(cè)定水分。稱(chēng)取煙草樣品0.5 g（精確至0.000 1 g）于250 mL 圓底燒瓶中，加入 100 mL 0.03 mol/L–80%鹽酸–乙醇溶液，加熱回流1 h，抽濾，用熱水潤(rùn)洗3遍，濾液定容至200 mL，得溶液a；濾渣轉(zhuǎn)移至200 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙酸–乙酸鈉緩沖溶液和40 μL果膠酶溶液，于53℃水浴酶解3 h，抽濾，濾液定容至200 mL，得溶液b；在100 mL磨口三角瓶中先后加入1 mL溶液a、20 mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液和40 μL果膠酶溶液，53℃水浴酶解1 h，將酶解液轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加入1 mL溶液b，定容，得溶液c，過(guò)0.45 μm濾膜后離子色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：Dionex CarboPac PA–10型（250 mm ×4 mm）分析柱，CarboPac PA–10型（50 mm×4 mm）保護(hù)柱；柱溫：30℃；淋洗液：水–250 mmol/L NaOH溶液 –1 mol/L NaAc溶液（體積比為 33∶55∶12），流速為1 mL/min；進(jìn)樣體積：25 μL；檢測(cè)器檢測(cè)模式：金電極脈沖安培檢測(cè)；檢測(cè)電位波形：四電位波形。

為了避免酶解液中糖類(lèi)物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)烈，對(duì)半乳糖醛酸信號(hào)的干擾，電化學(xué)檢測(cè)器從進(jìn)樣3 min后開(kāi)始采集信號(hào)。

1.4 果膠含量的計(jì)算

在1.3色譜條件下對(duì)標(biāo)樣和樣品中半乳糖醛酸濃度進(jìn)行分析檢測(cè)。采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。按下式計(jì)算樣品中果膠含量（以半乳糖醛酸計(jì)）：

式中：M——試樣中果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

n——溶液體積與酶解液取樣體積之比；

c——樣品溶液中半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度，mg/L；

V——溶液體積，L；

m——試樣質(zhì)量，mg；

W——試樣含水率，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物與酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 除糖和酸化條件選擇

YC/T 346–2010［12］中采用醇化除糖、鹽酸酸化處理樣品，兩步完成約需3 h。本實(shí)驗(yàn)直接采用酸醇混合溶液一步處理樣品，前處理過(guò)程中減少1次回流、1次過(guò)濾和3次洗滌，同時(shí)達(dá)到除糖和酸化效果，節(jié)約了1.5 h。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸性過(guò)強(qiáng)會(huì)使果膠水解，導(dǎo)致除糖酸化液中果膠含量升高，因此應(yīng)優(yōu)化前處理液的酸濃度。

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g煙草樣品3份，分別加入氫離子濃度為0.01，0.03，0.05 mol/L且醇體積分?jǐn)?shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液，加熱回流1 h，固液分離，濾液定容至200 mL，分別取1 mL濾液于100 mL磨口三角瓶中，加入20 mL pH 4的乙酸–乙酸鈉緩沖溶液和40 μL果膠酶溶液，于53℃水浴中酶解1 h，濾液定容至200 mL，用離子色譜法測(cè)定。表2數(shù)據(jù)顯示，采用氫離子濃度為0.03 mol/L且醇體積分?jǐn)?shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液處理樣品，除糖酸化液中未檢出半乳糖醛酸，除糖酸化酶解液中半乳糖醛酸含量為1.45%，說(shuō)明0.03 mol/L醇體積分?jǐn)?shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液不僅可有效去除煙草中的糖類(lèi)物質(zhì)，破壞植物細(xì)胞壁，殘?jiān)附夥磻?yīng)更徹底，而且煙草中的果膠僅微弱水解，除糖酸化液中的果膠的含量很低。

表2 不同氫離子濃度條件下半乳糖醛酸含量

2.1.2 酶用量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g煙草樣品6份，分別加入100 mL 0.03 mol/L醇體積分?jǐn)?shù)為80%的鹽酸–乙醇溶液，加熱回流1 h，固液分離，濾液定容至200 mL，分別取1 mL濾液于100 mL磨口三角瓶中，加入20 mL pH 4的乙酸–乙酸鈉緩沖溶液，再分別加入10，20，30，40，50，60 μL 果膠酶溶液，于 53℃水浴中酶解1 h，進(jìn)行離子色譜分析。濾渣轉(zhuǎn)移至200 mL磨口三角瓶中，加入100 mL乙酸–乙酸鈉緩沖溶液，分別加入 10，20，30，40，50，60 μL 果膠酶溶液，于53℃水浴中酶解3 h，進(jìn)行離子色譜分析。圖1表明當(dāng)加酶量大于40 μL后，半乳糖醛酸含量幾乎保持不變，故選擇酶用量為40 μL。圖2表明濾渣酶解規(guī)律與濾液相似，酶用量也為40 μL。

圖1 加酶量對(duì)濾液中果膠測(cè)定結(jié)果的影響

圖2 加酶量對(duì)濾渣中果膠測(cè)定結(jié)果的影響

2.1.3 酶解溫度的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g煙草樣品6份，除糖酸化后進(jìn)行固液分離，分別考察 10，25，38，53，65，78℃下果膠酶對(duì)濾液和濾渣中果膠水解影響（濾渣和濾液加酶量均為40 μL）。結(jié)果如圖3和圖4所示，由圖3、圖4可知，最佳酶解溫度為53℃。

圖3 酶解溫度對(duì)濾液中果膠測(cè)定結(jié)果的影響

2.1.4 酶解時(shí)間影響

圖4 酶解溫度對(duì)濾渣中果膠測(cè)定結(jié)果的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g樣品6份，除糖酸化后進(jìn)行固液分離，分別考察 0.5，1，2，3，5，7 h 后果膠酶對(duì)濾液和濾渣中果膠水解影響（濾渣和濾液加酶量均為40 μL、酶解溫度均為53℃），結(jié)果如圖5和圖6所示。由圖5、圖6可知，濾液最佳酶解時(shí)間為1 h，濾渣最佳酶解時(shí)間為3 h。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)濾液中果膠測(cè)定結(jié)果的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)濾渣中果膠測(cè)定影響

2.2 色譜條件的選擇

樣品中糖類(lèi)物質(zhì)響應(yīng)值過(guò)高（信號(hào)過(guò)強(qiáng)）會(huì)對(duì)半乳糖醛酸的響應(yīng)信號(hào)造成干擾，因此在進(jìn)樣3 min后開(kāi)始采集信號(hào)。圖7和圖8分別為煙草樣品在進(jìn)樣后直接采集信號(hào)和進(jìn)樣3 min后開(kāi)始采集信號(hào)的圖譜。由圖7、圖8可見(jiàn)，進(jìn)樣3 min后開(kāi)始采集信號(hào)，半乳糖醛酸色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)且無(wú)拖尾，方便直接積分，因此選擇進(jìn)樣3 min后開(kāi)始采集信號(hào)。

2.3 工作曲線(xiàn)與檢出限、定量限

稱(chēng)取30 mg （精確至0.1 mg）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，用二次去離子水溶解并定容至100 mL，作為半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取50，100，250，500，1 000，2 000 μL半乳糖醛酸儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用二次去離子水定容，分別得到質(zhì)量濃度為0.15，0.3，0.75，1.5，3，6 mg/L的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積y（nC·min）為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣11次，分別以3倍、10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限、定量限。線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見(jiàn)表3。

圖7 樣品進(jìn)樣后直接采集信號(hào)色譜圖

圖8 樣品進(jìn)樣3 min后采集信號(hào)色譜圖

表3 半乳糖醛酸的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程，相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限

2.4 精密度試驗(yàn)

稱(chēng)取5份煙草樣品，每份0.5 g （精確至0.1 mg），按照上述前處理和分析條件進(jìn)行平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果列于表4。由表4可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.92%，表明本方法具有較好的重復(fù)性。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果 %

2.5 回收試驗(yàn)

稱(chēng)取3份煙草樣品，每份0.5 g（精確0.000 1 g），分別加入高、中、低3個(gè)水平的果膠標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述前處理?xiàng)l件和分析條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，半乳糖醛酸回收率在93.57%～102.29%之間，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度較高。

表5 果膠回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 比對(duì)試驗(yàn)

利用該方法和YC/T 346–2010分別測(cè)定18種煙草樣品中的果膠含量，將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。利用表6中數(shù)據(jù)計(jì)算，得t=0.091 27，查表t0.025（17）=2.110，t＜t0.025（17），P＞0.05，表明兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法具有良好的一致性。

表6 18種煙草樣品中果膠測(cè)定結(jié)果 %

3 結(jié)語(yǔ)

采用酸醇溶液一步處理煙草樣品，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)除糖和酸化，減少1次回流、1次過(guò)濾和3次洗滌前處理，簡(jiǎn)化了樣品處理步驟，縮短了樣品處理時(shí)間。采用進(jìn)樣3 min后采集信號(hào)，可有效地避免因樣品中糖類(lèi)物質(zhì)響應(yīng)值過(guò)高對(duì)半乳糖醛酸響應(yīng)值造成的干擾。該法可用于煙草中果膠含量的批量測(cè)定。

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