陳 婧 劉 彬 周迎春 高潔嫦△

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 511447

2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，廣州 510260

3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 510515

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個復(fù)雜的病理生理過程，其形成的最早期特征是泡沫細(xì)胞的出現(xiàn)。抑制泡沫細(xì)胞形成甚至逆轉(zhuǎn)泡沫化已成為預(yù)防AS和治療冠心病的重要研究方向。番石榴葉為桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaL的干燥葉，是嶺南地區(qū)傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)理論認(rèn)為其性平，味甘澀，歸脾、胃、大腸、肝經(jīng)，具有止瀉、止血、止渴等功用?，F(xiàn)代藥理研究[1-2]表明，番石榴葉除抗炎、降血糖、降血脂等作用外，其主要活性成分之一的黃酮類化合物對于防治AS同樣具有良好療效[3]，然而其作用機(jī)制仍未十分明確。本實(shí)驗(yàn)利用THP-1單核-巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型作為研究對象，觀察番石榴葉總黃酮對泡沫細(xì)胞形成的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1購自美國模式菌種收集中心，ox-LDL與CCK-8試劑盒購自廣州奕源生物科技有限公司，佛波酯(PMA)購自Merck公司，番石榴葉總黃酮(純度55.22%)由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，總膽固醇測定試劑盒購自溫州東甌津瑪生物科技有限公司，Rabbit polyclonal to LOX-1(一抗)購自Abcam公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔(二抗)購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及泡沫細(xì)胞模型建立 THP-1細(xì)胞用含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度控制在106個/ml，每2 d換液1次，采用直接傳代法，每4 d傳代1次。傳至3～5代后用于建模。加入100 ng/ml的PMA，培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞，換成無血清培養(yǎng)液，并加入濃度為50 μg/ml ox-LDL，培養(yǎng)24 h，洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油紅O染色15 min，水洗5 min，蘇木精-伊紅染色5 min，蒸餾水漂洗返藍(lán)10 min，顯微鏡下觀察其形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.2 毒性實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)分組 THP-1分化為巨噬細(xì)胞后，加入用無血清培養(yǎng)液按梯度配制的不同濃度的番石榴葉總黃酮(15 μg/ml、30 μg/ml、60 μg/ml、120 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml)。24 h后加入10 μl CCK-8溶液，4 h后用多標(biāo)記微孔板檢測儀在450 nm波長下測定吸光度值，重復(fù)3次。根據(jù)CCK-8結(jié)果，在其安全范圍內(nèi)選取三個濃度分別作為低、中、高三個劑量組，并設(shè)空白對照組(無血清培養(yǎng)液)及ox-LDL模型組(無血清培養(yǎng)液+50 μg/ml ox-LDL)作為對照，5組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行各項(xiàng)檢測。

1.2.3 酶偶聯(lián)比色法檢測泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量 用NP-40裂解液裂解上述各組細(xì)胞，離心，取上清置于-80 ℃保存。用膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(517 mmol/L)作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。各樣品與測定試劑按1：20的比例充分混勻，置37 ℃水浴反應(yīng)10 min。以空白管校零，采用多標(biāo)記微孔檢測儀在545 nm波長下比色讀取吸光度值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品總膽固醇濃度，以μmol/g蛋白為單位。

1.2.4 Western blot法檢測LOX-1的蛋白表達(dá) 在各組蛋白樣品中加入上樣緩沖液，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉90 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜，1×TBS液洗滌3次，10 min/次，加入二抗，37 ℃孵育，1×TBS液洗滌3次，10 min/次。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，Kodak全光譜多功能活體成像系統(tǒng)曝光。Image tool V3.0圖像分析軟件讀取條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞模型鑒定

THP-1分化為巨噬細(xì)胞后加入ox-LDL作用，經(jīng)固定和油紅O染色，顯微鏡下見細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅染顆粒狀脂質(zhì)空泡較對照組巨噬細(xì)胞明顯增多，提示細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分增加，說明泡沫細(xì)胞基本形成。

2.2 不同濃度番石榴葉總黃酮對巨噬細(xì)胞活性的影響

500 μg/ml組細(xì)胞活力下降31.97%(P<0.01)，提示該濃度的番石榴葉總黃酮具有一定毒副作用。而250 μg/ml組細(xì)胞活力雖與對照組比較無顯著差異，但也呈下降趨勢。故本研究選取20、40、80 μg/ml三個濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以排除藥物自身對細(xì)胞的毒性作用。見表1。

表1 不同濃度番石榴葉總黃酮對巨噬細(xì)胞活性的影響比較

2.3 番石榴葉總黃酮對細(xì)胞總膽固醇含量的影響

與空白對照組比較，ox-LDL模型組細(xì)胞總膽固醇含量明顯增加(P<0.01)；與ox-LDL模型組比較，三個濃度番石榴葉總黃酮組細(xì)胞總膽固醇含量均明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞總膽固醇含量比較

2.4 各組細(xì)胞LOX-1的蛋白表達(dá)

與空白對照組比較，ox-LDL模型組細(xì)胞LOX-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。三個濃度的黃酮組LOX-1蛋白含量均低于ox-LDL組(P<0.01)，并隨黃酮濃度增高而降低(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

A：空白對照組；B：ox-LDL模型組；C：黃酮低劑量組；D：黃酮中劑量組；E：黃酮高劑量組

3 討論

脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞中蓄積形成泡沫細(xì)胞是AS的最早期病理特征。巨噬細(xì)胞通過多種表面受體無限制地?cái)z取ox-LDL及其他配體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量膽固醇及三酰甘油蓄積而轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，從而形成最早的AS病變——脂質(zhì)條紋。此外，泡沫細(xì)胞還可分泌多種炎癥因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，加速AS進(jìn)展[4]。

LOX-1是1997年Sawamura等[5]在牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的一種C型植物血凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體，可特異性地結(jié)合ox-LDL，是參與巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL的主要受體之一[6]。多項(xiàng)研究[7-8]證實(shí)LOX-1與泡沫細(xì)胞及AS形成關(guān)系密切，因此阻斷LOX-1是直接抑制巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL而形成泡沫細(xì)胞的重要靶點(diǎn)。此外，LOX-1還可激活多個細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞外基質(zhì)降解等病理反應(yīng)，導(dǎo)致AS形成加速并惡化[9-10]。因此，抑制LOX-1的表達(dá)是防治AS、保護(hù)血管內(nèi)皮的重要途徑。

黃酮類化合物是番石榴葉的主要活性成分之一。黃酮類化合物能有效治療冠心病、抑制AS，而且分子量小，能被人體迅速吸收，亦能通過血-腦屏障，對治療心腦血管疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，番石榴葉總黃酮明顯下調(diào)LOX-1表達(dá)，從而有效阻止巨噬細(xì)胞攝入ox-LDL而出現(xiàn)膽固醇蓄積，起到了抑制泡沫細(xì)胞形成的作用，并且該作用在一定濃度范圍內(nèi)隨番石榴葉總黃酮劑量增高而增強(qiáng)。鑒于LOX-1是介導(dǎo)一系列細(xì)胞信號通路的重要受體，參與AS斑塊形成、進(jìn)展到破裂的多個階段，所以能有效作用于這一靶點(diǎn)的番石榴葉總黃酮，除了能在AS形成初期起到抑制作用以外，還可能對冠心病治療、穩(wěn)定斑塊、保護(hù)血管內(nèi)皮等方面有一定療效，因而值得繼續(xù)深入探討其藥效和作用途徑。

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