左 龍，趙 越，李懷業(yè),李 凱,盧嘉賓，韓鴻賓

(1. 北京大學(xué)第三醫(yī)院放射科，北京 100191; 2.磁共振裝備與技術(shù)北京市重點實驗室, 北京 100191; 3.大連大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，大連116622; 4.北京積水潭醫(yī)院放射科，北京 100035)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占惡性腦腫瘤的81%[1]。膠質(zhì)瘤通常會導(dǎo)致顯著的致殘率和死亡率。在過去的幾十年中，治療方法不斷改進。目前，放療聯(lián)合化療是手術(shù)后的一線輔助治療[2]。然而，幾乎所有的膠質(zhì)母細胞瘤患者在7～10個月無進展生存期中位期后都會出現(xiàn)病情進展[3]。因此，膠質(zhì)母細胞瘤總體上難治且預(yù)后差。實際上大多數(shù)化療藥物不能通過血腦屏障，因而藥物到達腫瘤靶點的效率低下[4]。研究人員相繼發(fā)明了諸多新的治療策略，其中局部給藥可以直接繞過血腦屏障。局部給藥具體包括，局部注射、對流增強給藥和各種埋置多聚物。局部給藥可以將高生物利用度的制劑直接作用于靶點，而且?guī)缀鯖]有藥物損耗[5]。然而，溶液回流和水腫等多種副作用阻礙了對流增強給藥(CED)發(fā)展成一個用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療系統(tǒng)[6].

為克服上述缺陷，人們建立了一種磁共振實時成像的方法來監(jiān)測給藥過程[7-9]，但卻沒有定量計算局部擴散和清除參數(shù)。本課題組首先應(yīng)用磁共振示蹤技術(shù)定量測量了正常大鼠腦尾狀核、丘腦、枕葉皮質(zhì)和黑質(zhì)的擴散和清除參數(shù)[10，11]。本研究首次應(yīng)用磁共振示蹤技術(shù)定量比較了C6膠質(zhì)瘤10 d模型和20 d模型擴散和清除參數(shù)的差異，并且對影響擴散和清除的細胞外基質(zhì)成分進行了免疫組化和蛋白質(zhì)印跡分析比較。

1 材料和方法

1.1 溶液制備和實驗動物

用雙蒸水稀釋釓二乙三胺五乙酸 (Gd-DTPA，馬根維顯，拜耳先靈制藥，德國) 至10 mmol/L。本研究方案獲得了北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物倫理委員會的批準(zhǔn)(批號 No. LA2012-016)。16 只成年雄性 SD 大鼠，清潔級，體重(250～300)g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號 SCXK( 京) 2011-0012。實驗動物使用許可證號：SYXK(字)2011-0039。隨機分為兩組： 10 d膠質(zhì)瘤組(n=8)和20 d膠質(zhì)瘤組(n=8)。C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞系(ATCC No. CCL 107) 培養(yǎng)如以往報道。大鼠(n=8)經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉、乙醇、水合氯醛、硫酸鎂和丙二醇混合物(3 mL/kg)麻醉后，固定于立體定位儀(Stoelting, 美國)。在頭皮沿矢狀縫從兩耳間區(qū)域至兩眼間區(qū)域做正中切口，小心分離腦膜暴露前囟。右側(cè)顱骨表面定位鉆孔 (前囟前，1 mm；右旁開，3.5 mm)。C6細胞懸液(5 ×106cells in 10 μL)經(jīng)顱骨孔緩慢注入(10 min)右側(cè)尾狀核 (前囟前，1 mm；右旁開，3.5 mm；深，5.0 mm)。微量進樣器停針5 min。顱骨孔用骨蠟封閉，頭皮縫合。

1.2 MRI示蹤法示蹤大鼠C6膠質(zhì)瘤模型細胞外間隙擴散

大鼠麻醉如前所述，實驗過程中適時追加保持麻醉狀態(tài)(約為 0.7 mL/kg/h)。大鼠置于加熱墊(38 ± 0.5)°C上保持體溫。預(yù)掃描將大鼠置于西門子磁共振成像(Magnetom Trio，Germany)系統(tǒng)腕線圈中, 用 T1 加權(quán)三維磁化準(zhǔn)備快速采集梯度回波序列(T1 3D MP-RAGE)掃描[12]。獲得用于圖像后處理的預(yù)掃描圖像并用于確定穿刺位點。大鼠顱頂備皮，碘伏消毒。沿矢狀縫從兩耳間區(qū)域至兩眼間區(qū)域開頭皮，小心分離腦膜暴露前囟。將大鼠置于立體定位儀上, 根據(jù) MRI 預(yù)掃描結(jié)果顯示的腫瘤生長情況在顱骨表面重新定位鉆孔，向腫瘤中心區(qū)域微量注射10 mmol/L Gd-DTPA 溶液 2 μL(注射時間 10 min)。注射 Gd-DTPA 后不同時間點,15min、30 min、第1、2、3、4、5、6小時行磁共振掃描成像。成像序列和參數(shù)如前所述。

1.3 圖像后處理和參數(shù)計算

用 MATLAB7.8 軟件(MathWork, 美國)將注射后掃描圖像與預(yù)掃描圖像配準(zhǔn)后獲得減影圖像[13]。本課題組前期研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3.0T磁共振機應(yīng)用T1加權(quán)3D MP-RAGE序列掃描的Gd-DTPA濃度與信號強度增量(ΔSI)的線性關(guān)系[12]。與以往的1/T1值與Gd-DTPA濃度關(guān)系相比更有利于實時成像計算[14-16]。MRI示蹤法定量細胞外間隙擴散的主要參數(shù)包括自由擴散系數(shù) (D)，有效擴散系數(shù)(D*)，迂曲度 (λ)和清除速率常數(shù)(k’). 根據(jù)本課題組已經(jīng)報道的方法進行參數(shù)計算[17]。為測量腦組織間液流動參數(shù)半衰期(thalf-life)，將高于背景噪音兩個標(biāo)準(zhǔn)差的的信號強度作為閾值，逐層提取感興趣區(qū)內(nèi)的所有像素得到各掃描時間點Gd-DTPA總量(Gdsum)。由于Gd-DTPA在腦內(nèi)按一級動力學(xué)常數(shù)清除，Gd-DTPA的半衰期可以通過曲線擬合得到(Gdsum=e-kt)，其中半衰期(thalf-life)根據(jù)thalf-life=ln(2/k)進行計算。

1.4 免疫組化

選取典型的細胞外基質(zhì)大分子進行免疫組化分析[18-20]。5 μm石蠟切片脫蠟后，3%過氧化氫避光浸泡，抗原熱修復(fù)。分別滴加抗硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C、IV型膠原蛋白一抗(兔抗大鼠；1∶200；博奧森)，4℃過夜；加二抗常溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)

將上述大分子用蛋白質(zhì)印跡法進行檢測[21-23]。腫瘤組織取材，加入裂解液勻漿后離心，各取上清液50 μg點樣于12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶封閉。分別用硫酸軟骨素蛋白多糖抗體、腱生蛋白C抗體、抗IV型膠原蛋白(兔抗大鼠；1∶1 000；博奧森)或抗GAPDH(1∶10 000; 博奧森) 4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光檢測試劑( enhanced chemiluminescence，ECL)，X光膠片曝光，ImageJ軟件(國立衛(wèi)生院，美國)分析。以GAPDH蛋白作為系統(tǒng)內(nèi)參，測定條帶進行灰度值，以目的/內(nèi)參比值來比較表達的差異。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用SPSS軟件19.0版本進行 (IBM，美國)。所有結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的形式表示。用獨立樣本t檢驗比較兩組樣本的有效擴散系數(shù)(D*)，迂曲度(λ)，清除速率常數(shù)(k’)和半衰期(thalf-life)。用配對樣本t檢驗比較兩組樣本的蛋白印跡分析。P值小于0.05(P<0.05)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤10d模型和膠質(zhì)瘤20 d模型Gd-DTPA擴散參數(shù)和半衰期的比較

MRI矢狀位、橫軸位和冠狀位三個方向顯示不同時間點Gd-DTPA的擴散過程(圖1和2); Gd-DTPA導(dǎo)入細胞外間隙后，局部信號強度增高，隨后信號強度隨時間衰減至示蹤劑從細胞外間隙中清除。20 d膠質(zhì)瘤有效擴散系數(shù)(D*)明顯小于10 d膠質(zhì)瘤((6.67±1.78) ×10-5mm2/s vs. (1.26±0.27) ×10-4mm2/s; t=4.265;P<0.01)，導(dǎo)致迂曲度(λ)增大 (λ=(D/D*)1/2)((3.99±0.57) vs. (2.83±0.29);t=4.11;P<0.01) (圖3A)。測量清除速率常數(shù)(k’)，20 d膠質(zhì)瘤((7.67±2.29) ×10-5mm2/s) 小于10 d膠質(zhì)瘤 ((1.46±0.36) ×10-4mm2/s)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.87;P<0.05)(圖3A)。10d膠質(zhì)瘤半衰期(0.86±0.23 h)顯著小于20 d膠質(zhì)瘤(1.64±0.12 h) (t=5.91;P<0.01)(圖3B)。

注1：(A)矢狀位；(B)橫軸位；(C)冠狀位

注2：(A)矢狀位；(B)橫軸位；(C)冠狀位。

2.2 膠質(zhì)瘤10 d模型和20 d模型細胞外基質(zhì)表達的差異

注3：(A)擴散參數(shù)定量分析(D*,λ,k’) (B)Gd-DTPA的半衰期擬合曲線圖。(C)膠質(zhì)瘤10 d模型半衰期與膠質(zhì)瘤20 d模型半衰期統(tǒng)計分析(thalf-life)，** P<0.01。

為了更好地理解上述擴散參數(shù)(D*, λ 和k’)和半衰期(thalf-life)的差異，我們用免疫組化法觀察到20 d膠質(zhì)瘤中硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的表達(圖4B, 4D和4F)均較10 d膠質(zhì)瘤的表達(圖 4A, 4C和4E，圖4見封三)增高。Western blotting的定量結(jié)果進一步證實了這些發(fā)現(xiàn)。硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs/GAPDH)(圖 5A)在20 d膠質(zhì)瘤中(0.48±0.07)的表達均高于在10 d膠質(zhì)瘤中(0.32±0.09)的表達(t=4.663；P<0.01)，腱生蛋白C(Tenascin-C/GAPDH)亦然((0.29±0.04)vs.(0.58±0.11)；t=6.50;P<0.01)(圖5B)。20 d膠質(zhì)瘤中IV型膠原蛋白(collagen IV/GAPDH)(圖5C)的含量也高于10 d膠質(zhì)瘤((0.24±0.07)vs.(0.33±0.06)；t=3.81；P<0.05)。

3 討論

眾所周知，磁共振擴散加權(quán)成像(diffusion-weighted MRI)是一種能夠測量組織內(nèi)水分子擴散的成像技術(shù)，是腦腫瘤分級和判斷放化療療效方面的研究熱點[24-27]。但是由于擴散加權(quán)成像并不能區(qū)分細胞內(nèi)和細胞外的擴散且空間分辨力低，因而難以用于指導(dǎo)腦內(nèi)局部給藥[28]，實時磁共振示蹤技術(shù)應(yīng)運而生。

本研究應(yīng)用磁共振示蹤法定量研究了膠質(zhì)瘤模型在生長的第10天和第20天腫瘤細胞外間隙的有效擴散系數(shù)(D*)，清除速率常數(shù)(k’)和半衰期(thalf-life)等方面表現(xiàn)出了顯著的差異。這兩個時期的膠質(zhì)瘤細胞外擴散和清除的所具有的不同特征與膠質(zhì)瘤細胞外基質(zhì)的不同相關(guān)。20 d膠質(zhì)瘤細胞外基質(zhì)成分如硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白的增多，與20 d膠質(zhì)瘤有效擴散系數(shù)、清除速率常數(shù)的較小和半衰期的延長相對應(yīng)。

注5：(A) 硫酸軟骨素蛋白多糖Western blot分析；(B) 腱生蛋白C Western blot分析；(C) IV型膠原蛋白Westernblot分析；** P<0.01,* P<0.05.

通常，腫瘤體積的增大是腫瘤進展的重要標(biāo)志[29]。腫瘤細胞植入后，腫瘤體積隨時間逐漸增大，即為腫瘤進展[30]。腫瘤細胞外間隙的擴散對于腫瘤細胞攝取營養(yǎng)物質(zhì)，和抗腫瘤藥物到達治療靶點作用于腫瘤都至關(guān)重要[31]。細胞外基質(zhì)成分是影響腦腫瘤細胞外間隙擴散的重要因素之一[32， 33]，可以增加細胞外間隙粘滯度，降低擴散速率[34]。細胞外基質(zhì)的存在增加了分子運動的粘滯阻力，使細胞外間隙不再是自由擴散介質(zhì)[35]。以往文獻報道，硫酸軟骨素蛋白多糖、腱生蛋白C和IV型膠原蛋白在膠質(zhì)瘤細胞外間隙中高表達，并隨著腫瘤生長進展含量逐漸升高[22， 36-40]。本研究的結(jié)果與以往文獻報道一致。腦細胞外間隙占腦容積的20%，腦細胞間約50 nm的空隙內(nèi)含細胞外基質(zhì)[41， 42]。目前認為細胞外基質(zhì)成分可降低溶質(zhì)分子或膜相關(guān)分子的擴散[34]。膠質(zhì)瘤細胞外基質(zhì)分子種類較多，主要包括蛋白多糖、糖蛋白、膠原纖維等成分[43]。本研究中的硫酸軟骨素蛋白多糖，腱生蛋白C和IV型膠原蛋白分別是上述三種主要成分的典型代表分子，在ECS中含量較高，參與構(gòu)成膠質(zhì)瘤細胞生長的微環(huán)境，并影響膠質(zhì)瘤細胞的進展轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，而受到廣泛關(guān)注[36]。另外由于幾種成分之間往往相互連接構(gòu)成復(fù)合結(jié)構(gòu)[43]，所以選取典型細胞外基質(zhì)分子有助于對于膠質(zhì)瘤細胞外間隙的分析。本研究局限性在于只是選取了典型的細胞外基質(zhì)分子，未來需要對于細胞外基質(zhì)的各種分子對擴散的影響進行更全面的研究，并進一步對不同類型膠質(zhì)瘤擴散參數(shù)和細胞外基質(zhì)的表達進行定量研究。

腫瘤分期是腫瘤學(xué)研究的基本內(nèi)容之一。國際抗癌聯(lián)盟 (UICC) 美國癌癥聯(lián)合會(AJCC) 的TNM分期系統(tǒng)[44]是五十多年來評估腫瘤患者預(yù)后的參考[45]。但是自第五版以來，TNM分期已不再包含原發(fā)性腦腫瘤的內(nèi)容[44]。目前使用的是世界衛(wèi)生組織(WHO)分類標(biāo)準(zhǔn)，將原發(fā)性腦腫瘤分為星形細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤和混合型膠質(zhì)瘤[46]。有學(xué)者認為將腫瘤體積、浸潤情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等考慮在內(nèi)可將腫瘤進一步分期[47]，并認為T分期(腫瘤大小)是制定各期神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療方案的重要參考[48]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)兩個時期的膠質(zhì)瘤擴散參數(shù)明顯不同，提示局部給藥參數(shù)應(yīng)根據(jù)腫瘤進展情況進行調(diào)整。

局部給藥是治療惡性膠質(zhì)瘤的新方法和新希望。實時MRI示蹤技術(shù)將有助于我們更好地研究膠質(zhì)瘤細胞外間隙擴散的生物學(xué)基礎(chǔ)，有助于惡性膠質(zhì)瘤局部治療的發(fā)展。

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