趙月明，任國(guó)譜

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)沙410004；2.湖南省亞華乳業(yè)控股有限公司中心實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)沙410004)

0 引 言

蠟樣芽孢桿菌是一種無(wú)莢膜，能運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)芽孢，兼性好氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生致吐、致腹瀉的腸毒素,人在食用被蠟樣芽胞桿菌污染的食品后,一般在8～16 h內(nèi)出現(xiàn)嘔吐或腹瀉,或兩者兼有的中毒癥狀[1]。偶爾能導(dǎo)致眼部感染，心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾病[2]。 因?yàn)橄灎钛挎邨U菌廣泛存在于土壤、空氣、水和塵埃中，所以無(wú)法避免地會(huì)污染食品[3]。原料奶的污染來(lái)源主要有奶牛的糞便、飼料，水和土壤，其次是奶罐和加工場(chǎng)的機(jī)械管道。產(chǎn)生腸毒素的蠟樣芽孢桿菌菌株已經(jīng)從許多種食品中分離出來(lái),在原料乳中分離的83株菌中有85%是致腹瀉毒素陽(yáng)性菌株[4]。在乳品行業(yè)，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒極可能被誤認(rèn)為是乳糖不耐癥而被忽視。本文概述蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法及其在乳制品中的污染情況，為追溯其污染情況源及建立相應(yīng)防控措施提供理論依據(jù)。

1 蠟樣芽孢桿菌對(duì)乳制品的污染情況

乳制品在加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)均易受蠟樣芽孢桿菌污染，該菌可以通過(guò)泥土、灰塵、昆蟲(chóng)、不潔用具和從業(yè)人員的手而傳播，研究表明食品中蠟樣芽孢桿菌污染程度為104CFU/mL時(shí)就會(huì)對(duì)人體造成潛在的健康威脅從而不適于消費(fèi)者食用[5]，當(dāng)菌落含量超過(guò)105CFU/mL時(shí)，就有可能爆發(fā)食物中毒事件[6]。在1986～2007年發(fā)生的227起蠟樣芽孢桿菌嘔吐型食物中毒事件，有2.6%是由乳及乳制品引起的，34起腹瀉型食物中毒事件5.9%是由乳及乳制品引起的[7]，這其中不包括被誤當(dāng)做乳糖不耐癥而被忽視的。嬰幼兒免疫功能低，葉紅萍[8]曾報(bào)道1例試用嬰幼兒配方奶粉引起的腹瀉檢出蠟樣芽孢桿菌，其菌落總數(shù)為160CFU/g,遠(yuǎn)低于105CFU/mL，亦能致病。其中有2起是嬰兒奶粉和2起利樂(lè)包包裝的椰子奶。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)有關(guān)乳制品中蠟樣芽孢桿菌的研究和檢測(cè)主要集中在原料奶和嬰幼兒配方奶粉，其污染情況的部分研究如表1所示。

2 蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法

2.1 常規(guī)鑒定方法

傳統(tǒng)檢測(cè)方法是將分離培養(yǎng)后的可疑菌落做生化反應(yīng)試驗(yàn)，溶血試驗(yàn)，協(xié)同溶血試驗(yàn)，動(dòng)物試驗(yàn)，典型運(yùn)動(dòng)等鑒定，被確定為蠟樣芽孢桿菌后進(jìn)一步進(jìn)行血清分型。目前我國(guó)常用的蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)方法是國(guó)標(biāo)法GB 4789.14-2003，以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0176-1992(進(jìn)出口食品蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法)和SN/T 255211-2010(乳及乳制品微生物學(xué)檢驗(yàn)方法)。常規(guī)檢驗(yàn)步驟為[19]：樣品→增菌→分離培養(yǎng)(并作菌數(shù)測(cè)定)、分離純化→革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應(yīng)試驗(yàn)→腸毒素檢查。這種方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且需要較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行選擇性增菌過(guò)程[20]。

目前檢測(cè)方法中常用的選擇性培養(yǎng)基主要有蠟樣芽孢桿菌選擇瓊脂(PEMBA)、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基 (MYP)，顯色培養(yǎng)基主要是BCM。PEMBA已經(jīng)是國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO)公認(rèn)的檢驗(yàn)蠟樣芽孢桿菌的選擇性培養(yǎng)基，主要用于臨床樣本。MYP廣泛用于蠟樣芽孢桿菌的分離和計(jì)數(shù)。BCM和MYP相比菌落技術(shù)和分離更容易，有較高選擇性，能形成離散的不連在一起的菌落[21]。

表1 乳制品中蠟樣芽孢桿菌污染情況

2.2 快速檢測(cè)方法

2.2.1 PCR法

(1)普通PCR方法

Tsen等[22]設(shè)計(jì)了16S核糖體RNA的引物，以此為基礎(chǔ)建立PCR來(lái)定量檢測(cè)。王振國(guó)等[23]通過(guò)擴(kuò)增致病性蠟樣芽孢桿菌的hblA基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)。

ELSE M F等[24]建立了實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法；王振國(guó)等[25]利用SYBR Green I染料能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出一種用來(lái)檢測(cè)致病性蠟樣芽孢桿菌的實(shí)時(shí)PCR方法；王紅等[26]建立實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌以及溶血素HBL和非溶血素NHE。

普通PCR電泳法和實(shí)時(shí)熒光PCR法比較結(jié)果如表2。

表2 普通PCR與熒光PCR比較

利用PCR技術(shù)對(duì)食品中的蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)較常規(guī)方法具有省時(shí)省力的特點(diǎn)且靈敏性較高，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但這些方法的缺點(diǎn)是不能特異性檢測(cè)到靶生物，不能檢測(cè)到所有的從食品中分離的蠟樣芽孢桿菌，靈敏度低。蠟樣芽孢桿菌形成的芽孢也給PCR檢測(cè)帶來(lái)了不便。多數(shù)情況下都需要將菌在適合的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8～15 h后，大大延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間[27]。

與常規(guī)PCR電泳方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR無(wú)須電泳，與其他非致病蠟樣芽孢桿菌及其他菌株均無(wú)交叉反應(yīng)，可以直接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，且可避免擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室的污染，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。但該法容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)引物要求較高，檢驗(yàn)成本也較高[23]。

Hikmate Abriouel等[28]用 重 復(fù) 序列引物聚合酶鏈反應(yīng) (repetitive element sequence-based PCR)和16S rDNA順序序列分析的方法來(lái)區(qū)分同源關(guān)系的蠟樣芽孢桿菌組.

Eulyoung Choo等[29]設(shè)計(jì)出多重PCR快速鑒定蠟樣芽孢桿菌的方法；蔣培余等[30]通過(guò)設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立多重實(shí)時(shí)PCR，檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌16S rRNA保守區(qū)基因及其ces基因 (編碼致嘔毒素cereulide)與菌株鑒定結(jié)果的符合率為100%，ces基因檢測(cè)結(jié)果與普通PCR結(jié)果相符。李洋洋等[31]建立了同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒奶粉中坂崎桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的多重PCR方法。

黃訓(xùn)端等[32]利用VITEK自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定草莓蠟樣芽孢桿菌,與分子生物學(xué)的驗(yàn)證后結(jié)果一致，表明VITEK的可靠性和準(zhǔn)確性。趙寧等[33]針對(duì)目前原料乳中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)方法的繁瑣、費(fèi)時(shí)、耗力，建立了一種操作簡(jiǎn)便的快速檢測(cè)方法，采用過(guò)濾富集菌體后PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)原料乳中蠟樣芽孢桿菌。整個(gè)過(guò)程只需6 h左右即可完成，檢測(cè)靈敏度高達(dá)10 CFU/mL這種方法是對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的有效改進(jìn)，并且達(dá)到了原料乳檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏的要求。

2.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

齊哲[34]開(kāi)發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法。該法以蠟樣芽孢桿菌溶血素基因的hblA基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，將FTA濾膜提取DNA與LAMP法相結(jié)合，檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌和人工污染蠟樣芽孢桿菌的消毒乳。LAMP方法檢測(cè)靈敏度高，蠟樣芽孢桿菌的檢出限為4.4 mL-1，比PCR檢測(cè)靈敏度高10倍；人工污染消毒乳中蠟樣芽孢桿菌的檢出限57 mL-1。LAMP擴(kuò)增可在20 min內(nèi)完成，對(duì)消毒乳中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè) (包括DNA提取、LAMP和電泳)可在2 h內(nèi)完成.該方法靈敏度高、特異性好、耗時(shí)短。

2.2.3 PCR—DHPLC法

鄭秋月等[35]應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)對(duì)食品中污染的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。該法是根據(jù)蠟樣芽孢桿菌gyrB特異基因序列的特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)。結(jié)果表明該方法具有很高的特異性，靈敏度高，檢出限可達(dá)10 mL-1，快速簡(jiǎn)便。

2.2.4 微生物專用酶快速反應(yīng)系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)

張淑紅等[36]利用特異性酶法鑒定致病菌的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種用來(lái)檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的顯色快速檢測(cè)方法。該法利用特異性酶反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)了蠟樣芽孢桿菌顯色培養(yǎng)基(HKCB)，通過(guò)人工污染樣品和實(shí)際樣品檢驗(yàn)，分析，結(jié)果表明顯色培養(yǎng)基HKCB與傳統(tǒng)平板MYP可以達(dá)到相同的檢測(cè)限和靈敏度，且具有較高的特異性。

2.2.5 免疫學(xué)方法

檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌腸毒素的免疫學(xué)方法主要有免疫乳膠凝集試驗(yàn)、反向簡(jiǎn)介凝血試驗(yàn)、反向被動(dòng)乳膠凝集試驗(yàn)、放射免疫法、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)及免疫印跡法等。CHEN CH等[37]報(bào)道了用蛋白印記技術(shù)(Colony Blot Immunoassay，CBI)快速檢測(cè)蠟樣芽抱桿菌的方法。

Nadine[38]等用酶聯(lián)免疫技術(shù)選擇出兩種抗蠟樣芽孢桿菌的單克隆抗體，這兩種單抗均與蠟樣芽孢桿菌活菌體反應(yīng)，且不與起芽孢反應(yīng)，并研究了聯(lián)合這兩種抗體來(lái)檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的方法，此方法檢測(cè)的最低限為102mL-1。

Chen[39]等運(yùn)用免疫學(xué)方法，通過(guò)蠟樣芽孢桿菌特定的表面抗原與特異的抗體相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蠟樣芽孢桿菌快速檢測(cè)。此方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

3 乳制品中蠟樣芽孢桿菌的防控措施

蠟狀芽孢桿菌污染牧場(chǎng)環(huán)境和生乳，既有致病性，也影響牛奶的質(zhì)量，可造成牛奶的“甜酪”和“凝結(jié)乳脂”現(xiàn)象，導(dǎo)致淡煉乳出現(xiàn)凝塊、苦味、酸味和腐敗味[40]。

要防止蠟樣芽孢桿菌污染乳制品，尤其是防止嬰幼兒奶粉的污染，預(yù)防可能危害人體健康的潛在危險(xiǎn)產(chǎn)生，就必須從原料乳開(kāi)始，對(duì)生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，可能產(chǎn)生污染的各種可能性進(jìn)行分析，并制訂相應(yīng)的預(yù)防措施，建立監(jiān)測(cè)方法，將原料乳生產(chǎn)中微生物指標(biāo)提前控制，尤其要控制芽孢的數(shù)量，使其危害程度降到最低。建立并嚴(yán)格執(zhí)行行之有效的HACCP(危害分析和關(guān)鍵控制點(diǎn))系統(tǒng)，并把腸桿菌科作為生產(chǎn)線的衛(wèi)生指標(biāo)菌。要防止蠟樣芽孢桿菌的污染，必須在乳制品加工過(guò)程中對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格消毒，同時(shí)通過(guò)適當(dāng)巴氏殺菌、超高溫殺菌或其他高溫工藝可徹底的殺滅該菌。

近年來(lái)，研究者們對(duì)于蠟樣芽孢桿菌的抑制作用做了很多研究。韓永霞，殷文正[41]等研究了溫度、pH值、紫外線、固態(tài)介質(zhì)對(duì)牛乳中蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，研究表明，0℃以下和63℃以上不繁殖，65～70℃菌體易死去；耐酸堿范圍廣pH值為5～9，pH值大于10和pH值小于2時(shí)不生長(zhǎng)；與氧氣接觸時(shí)生長(zhǎng)更快，紫外線照射雖能抑制該菌的生長(zhǎng)，但照射兩小時(shí)后仍能較好生長(zhǎng)。

王忠堂，姚詠明等[42]探討了不同質(zhì)量濃度核黃素對(duì)雙歧桿菌、蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)核黃素對(duì)雙歧桿菌和蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,一定質(zhì)量濃度核黃素還可提高菌懸液中雙歧桿菌和蠟樣芽孢桿菌的長(zhǎng)期存活率。

莫金觀，鄧金花等[43]比較了不同消毒劑對(duì)蠟樣芽孢桿菌的殺滅效果，結(jié)果表明，過(guò)氧乙酸和二氧化氯對(duì)蠟樣芽孢桿菌殺滅效果較好，?？捎糜趯?duì)環(huán)境、生產(chǎn)場(chǎng)地、食品用具消毒。在乳制品中可以用于車間設(shè)備管道、室內(nèi)空氣以及工作人員手和衣物的清洗和消毒。

黃現(xiàn)青，史苗苗等[44]的研究結(jié)果表明，殼聚糖、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸的最小抑菌質(zhì)量濃度分別是10，2.5，0.039 g/L，以牛奶為介質(zhì)，殼聚糖、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸的質(zhì)量濃度分別為5，0.02，0.01 g/L這一組合條件下對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑制作用最好，對(duì)蠟樣芽孢桿菌殺菌率達(dá)83.5%。

喬支紅，程永強(qiáng)等[45]通過(guò)研究乳酸對(duì)3種食源性致病菌的抑菌及殺菌作用，說(shuō)明了乳酸對(duì)致病菌的抑菌、殺菌作用主要是通過(guò)延長(zhǎng)致病菌的代時(shí)及破壞正常的細(xì)胞電位達(dá)到的。乳酸對(duì)蠟樣芽孢桿菌最小抑菌質(zhì)量濃度3.6 g/L、最小殺菌質(zhì)量濃度7.2 g/L。

孟浩浩，李婷等[46]對(duì)牛乳UHT處理前后所含芽孢桿菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明超高溫瞬時(shí)殺菌可以使蠟樣芽孢桿菌完全失活，實(shí)現(xiàn)商業(yè)無(wú)菌，保證乳品質(zhì)量。

4 結(jié)束語(yǔ)

蠟樣芽孢桿菌作為一種條件致病菌，目前，研究者對(duì)它的污染來(lái)源、微生物特性、檢測(cè)方法以及乳制品中的污染情況等方面已做了大量研究，這對(duì)于減少蠟樣芽孢桿菌的危害具有重要的指導(dǎo)意義。但是目前乳制品生產(chǎn)過(guò)程中污染的蠟樣芽孢桿菌是由于哪個(gè)生產(chǎn)工序引起還是未知的，而且許多檢測(cè)方法和防控該菌的技術(shù)方法還處于理論研究階段。相信隨著研究的深入，防控蠟樣芽孢桿菌污染乳制品的有效措施將被推出，從而真正做到防患于未然。國(guó)家嬰幼兒配方食品食品安全標(biāo)準(zhǔn)(GB10765-2010)[47]中，對(duì)蠟樣芽孢桿菌等條件致病菌沒(méi)有明確的規(guī)定。鑒于蠟樣芽孢桿菌的致病性以及其芽孢很強(qiáng)的抵抗能力和繁殖能力，建議嬰幼兒配方奶粉的國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)微生物限量指標(biāo)中，增加蠟樣芽孢桿菌等條件致病菌指標(biāo)，確保嬰幼兒乳品等食品的安全可控。

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