趙從波，章淑艷，羅同陽，李賓

(河北省微生物研究所，河北 保定 071051)

0 引 言

乳糖酶(Lactase)學(xué)名β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrase),能夠水解β-D-半乳糖苷和α-L-阿拉伯糖苷，而催化乳糖的實(shí)用意義較大，故被研究得最多［1］。牛乳和乳清中含有大量乳糖，它是乳制品中的主要碳水化合物，乳糖酶的存在是乳糖在人體內(nèi)進(jìn)行正常代謝的一個(gè)必要條件，如果數(shù)量缺少或活性不夠，就會(huì)導(dǎo)致消化障礙［2］。近年來，對(duì)米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母等菌株乳糖酶的研究報(bào)道較多，而對(duì)青霉乳糖酶的研究相對(duì)較少。本文利用一株青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，為提高乳糖酶的酶活，采用PB設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究，確定了最佳產(chǎn)酶條件，以期為乳糖酶的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

菌株：青霉 Aspergillus oryzae。

主要試劑：鄰硝基苯酚(ONP)，鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷 (ONPG),pH值為5.5濃度為0.02 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液。

培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，乳糖5 g，蛋白胨6 g，玉米漿3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，KH2PO40.5 g，Tween-80 1.5 mL，水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 單孢子懸液的制備

取30℃條件下培養(yǎng)4 d的斜面菌種,加10 mL的無菌生理鹽水,將孢子振蕩打散,用帶脫脂棉的漏斗進(jìn)行過濾,然后用無菌生理鹽水將孢子懸液稀釋。血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度。

1.2.2 培養(yǎng)方法

將菌種轉(zhuǎn)接斜面活化,待孢子成熟后制備孢子懸液,接種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,接種量104mL-1。發(fā)酵條件:30℃,200 r/min,裝液量100 L/500 L。

1.2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

ONP標(biāo)準(zhǔn)液的制備：稱取139.0 mg的鄰硝基苯酚，用10 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至1 000 mL的容量瓶中，用水定容并搖勻。

分別移取鄰硝基苯酚儲(chǔ)備液2，4，6，8，10，12 mL和14 mL到100 mL的容量瓶中，分別加入25 mL的碳酸鈉溶液，再用反應(yīng)緩沖液定容至刻度，搖勻，溶液鄰硝基苯酚的濃度分別是0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mmol/L和0.14 mmol/L。選擇合適的分光光度計(jì)，用1 cm的吸收池，用水作空白，在420 nm處測(cè)定每個(gè)稀釋液的吸光度［3］，結(jié)果如表1所示。

表1 不同濃度鄰硝基苯酚420 nm處吸光度

以420 nm處吸光度為橫坐標(biāo)，鄰硝基苯酚的濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳糖酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 粗酶液的制備

發(fā)酵液在4℃條件下，10 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定酶活。

1.2.5 酶活測(cè)定

鄰硝基苯酚β-D半乳糖苷(ONPG)溶于濃度為0.02 mol/L乙酸緩沖液(pH值為5.5)配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的底物溶液。取400 μL酶液加入1 600 μL底物溶液中，50℃保溫15 min。加入2 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3顯色，測(cè)定420 nm光吸收值。計(jì)算水解產(chǎn)物鄰硝基酚(ONP)的含量和酶活性。

酶活力單位定義：一個(gè)酶活單位(U)即在55℃和pH值5.5條件下每分鐘將ONPG分解為l μmol黃色的ONP所需的酶量。

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化方法

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法。

2 結(jié)果分析

2.1 PB設(shè)計(jì)篩選主要因素

PB設(shè)計(jì)法是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它可以用最少的試驗(yàn)次數(shù)使各因素的主效應(yīng)得到盡可能精確的估計(jì)，從眾多考察因素中快速篩選出最為重要的幾個(gè)因素，以供進(jìn)一步研究［4］。本研究選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的設(shè)計(jì)，培養(yǎng)基中的8種成分：葡萄糖、乳糖、蛋白胨、玉 米 漿 、MgSO4·7H2O、 K2HPO4·3H2O、 KH2PO4、Tween-80，分別作為PB設(shè)計(jì)中的8個(gè)因素x1x2x3…x8，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，低水平“–”為原始培養(yǎng)條件，高水平 “+”取低水平的1.25倍。響應(yīng)值為乳糖酶酶活(Y)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及編碼如表2所示；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立均采用Minitab 16軟件來進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示，各因素效應(yīng)及評(píng)價(jià)如表4所示。

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及編碼

表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 各因素效應(yīng)值及顯著性分析

由表4可以看出，葡萄糖、乳糖和玉米漿對(duì)青霉產(chǎn)乳糖酶的結(jié)果有顯著影響，可信度均大于95%，3個(gè)因素均為正效應(yīng)，因此，提高3個(gè)因素的濃度可以提高乳糖酶的酶活。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

由于葡萄糖、乳糖和玉米漿3個(gè)因素的濃度對(duì)乳糖酶的酶活有顯著影響，且均為正效應(yīng)，應(yīng)提高濃度。根據(jù)效應(yīng)的大小確定爬坡步長，逼近最大區(qū)域。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5得知，最佳結(jié)果在實(shí)驗(yàn)3和4之間，故以實(shí)驗(yàn)3為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)做響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化最佳培養(yǎng)基

利用minitab16軟件，根據(jù)Box-behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以葡萄糖、乳糖和玉米漿為自變量，以乳糖酶酶活為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)因素水平如表6所示，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表7所示。

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)變量及水平

表7 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以乳糖酶酶活為響應(yīng)值，根據(jù)表7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用minitab16軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得到的回歸方程為：

分析結(jié)果如表8和表9所示。

模型的相關(guān)系數(shù)R2=98.12%，調(diào)整后R2=94.74%，說明此模型與實(shí)驗(yàn)擬合很好，能夠很好地預(yù)測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基組分與乳糖酶酶活的關(guān)系。

表8 回歸系數(shù)檢驗(yàn)

表9 方差分析結(jié)果

構(gòu)建乳糖酶酶活與發(fā)酵培養(yǎng)組分葡萄糖、乳糖和玉米漿的三維空間響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖2 Y與x1，x2的響應(yīng)面

圖3 Y與x1，x3的響應(yīng)面

圖4 Y與x2，x3的響應(yīng)面

由圖2～圖4可以看出，此模型具有最大值，利用minitab16軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行優(yōu)化，最大處x1=0.2323，x2=-0.2929，x3=0.6162， 以上代碼換算可得：x1=36.2，x2=6.7，x3=4.4，在此條件下，預(yù)測(cè)的乳糖酶酶活為123.6 U/mL。

2.4 模型的驗(yàn)證

為了確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化的培養(yǎng)基和初始培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，分別做了3組平行實(shí)驗(yàn)。乳糖酶的酶活達(dá)到了124.3 U/mL，與預(yù)測(cè)值非常接近，僅相差0.57%，比初始培養(yǎng)提高了32.3%。

3 結(jié) 論

Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法在微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化中廣泛應(yīng)用，并取得了良好的效果，本研究應(yīng)用這兩種方法對(duì)青霉液體發(fā)酵產(chǎn)乳糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖36.2 g/L，乳糖6.7 g/L，蛋白胨6 g/L，玉米漿4.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，Tween-80 1.5 mL/L。 在此條件下，乳糖酶的酶活比初始培養(yǎng)基提高了32.3%。

[1]陳鞠聲,胡學(xué)智.酶制劑生產(chǎn)技術(shù)[M].北京:工業(yè)出版社,1994：416-423.

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