黃曉林，宋戈

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶163000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150028)

0 引 言

香蘭素是一種合成香精，通常分為香蘭素和乙基香蘭素，還有鄰位香蘭素，具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香。人體大量攝入香蘭素等食品添加劑會(huì)導(dǎo)致頭暈、惡心、嘔吐,還會(huì)影響肝臟、腎臟的功能[1]。食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[2]中明確規(guī)定規(guī)定了較大嬰兒和幼兒配方食品中香蘭素使用限量,嬰幼兒谷類輔助食品中也可以使用香蘭素，但0至6個(gè)月嬰幼兒配方食品不得添加任何食用香料。目前，尚無(wú)嬰幼兒配方食品中香蘭素及衍生物的官方檢測(cè)方法，文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法有高效液相色譜法[3]、氣相色譜[4-5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-8]等，這些方法或靈敏度低，或操作繁瑣，或?qū)υO(shè)備要求高。本文采用高效液相色譜紫外檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定了嬰幼兒配方食品和乳粉中香蘭素及衍生物的含量,方法簡(jiǎn)單、快速,靈敏度高，重現(xiàn)性好，在實(shí)際樣品應(yīng)用中得到了滿意結(jié)果。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測(cè)器，酸度計(jì),漩渦振蕩器,超聲提取儀。

1.2 試劑

香蘭素、乙基香蘭素和鄰位香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)，用乙腈配置成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的儲(chǔ)備液，使用前用水稀釋到所需的質(zhì)量濃度；乙腈，甲醇均為色譜純；磷酸二氫鉀，醋酸銨等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，柱溫為20℃；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；測(cè)定波長(zhǎng)為276 nm；流動(dòng)相為濃度0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH=4.0)-乙腈(體積比為75∶25)；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min。

1.3.2 樣品處理

谷類輔助食品：稱量2～4 g到三角瓶中，加入0.5 g淀粉酶和40℃以下的水25 mL，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。乳粉：稱量2～4 g到三角瓶中；加入40℃以下的水25 mL溶解，旋渦振蕩1 min，冰水浴超聲10 min；然后用鹽酸溶液調(diào)pH值至1.7,用氫氧化鈉調(diào)pH值至4.5，定容到50 mL，搖勻后用濾紙過(guò)濾，吸取10 mL濾液到三角瓶中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7，分多次洗入已經(jīng)活化過(guò)的MAX固相萃取柱,依次用5%氨水3 mL、甲醇3 mL淋洗,再用4%甲酸甲醇溶液3 mL洗脫,在40℃下吹干后用流動(dòng)相定容到1 mL,旋渦振蕩溶解后用0.45 m濾膜過(guò)濾,供分析測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在滿足分離效果，達(dá)到待測(cè)物質(zhì)與雜質(zhì)基本分離的條件下，應(yīng)選擇能改善待測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)，提高靈敏度的流動(dòng)相。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸鹽溶液作流動(dòng)相時(shí)待測(cè)物質(zhì)分離度和靈敏度比甲醇-磷酸鹽溶液作流動(dòng)相時(shí)高，而且系統(tǒng)壓力小。本實(shí)驗(yàn)還考察了乙酸銨、硫酸銨和檸檬酸銨等溶液作為緩沖溶液時(shí)對(duì)分離測(cè)定的影響，結(jié)果顯示，乙腈-磷酸鹽溶液作流動(dòng)相時(shí)分離效果和待測(cè)物質(zhì)靈敏度都比較理想。另外通過(guò)改變流動(dòng)相中緩沖溶液的濃度與pH值比較被測(cè)組分的色譜峰和分離度，確定流動(dòng)相的緩沖溶液的濃度與pH值。當(dāng)磷酸鹽溶液的濃度為分別為0.01，0.02，0.05，0.10 mol/L時(shí)，對(duì)分離影響不大，但隨著磷酸鹽溶液濃度的增加，待測(cè)物質(zhì)的出峰時(shí)間愈穩(wěn)定，考慮到緩沖鹽濃度增大，對(duì)色譜柱及系統(tǒng)管路造成的損害也會(huì)加大，所以選擇濃度為0.05 mol/L的磷酸鹽溶液作為緩沖溶液。調(diào)節(jié)濃度為0.05 mol/L磷酸鹽溶液pH值分別為 5.0，4.5，4.0，3.5，3.0；隨著磷酸鹽溶液pH值的降低，峰形越來(lái)越對(duì)稱而且尖銳，重復(fù)性也越來(lái)越好，考慮到色譜柱的耐酸程度，調(diào)節(jié)濃度為0.05 mol/L磷酸鹽溶液pH值為4.0較為合適。為了縮短分析時(shí)間，通過(guò)試驗(yàn)最終確定濃度為0.05 mol/L磷酸鹽溶液與乙腈的比例為75比25。標(biāo)準(zhǔn)樣品、含香蘭素及其衍生物樣品、空白樣品的色譜如圖1～圖3所示。按出峰順序依次為甲基香蘭素、乙基香蘭素和鄰位香蘭素。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜

圖2 含香蘭素及其衍生物樣品的色譜

圖3 空白樣品的色譜

2.2 前處理的選擇

前期處理的選擇與后期固相萃取凈化濃縮息息相關(guān)。除去樣品中蛋白質(zhì)和脂肪的方法有很多，例如用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復(fù)合沉淀劑，用有機(jī)試劑甲醇和乙腈沉淀，加入堿和硫酸銅沉淀，用酸堿調(diào)節(jié)pH沉淀等等。進(jìn)行樣品的凈化時(shí)，樣品溶液的pH值要大于香蘭素及其衍生物的pKa兩個(gè)單位，使其以陰離子的形式存在，上樣時(shí)才能萃取柱被保留。前期處理時(shí)選擇用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復(fù)合沉淀劑或加入堿和硫酸銅沉淀樣品中的蛋白，過(guò)濾后取部分濾液調(diào)整pH值到7時(shí)，有沉淀出現(xiàn)影響萃取凈化；而用有機(jī)試劑甲醇和乙腈沉淀，取部分濾液調(diào)整pH值到7后上樣由于溶液中有機(jī)相比例大，會(huì)穿透萃取柱，造成被測(cè)物流失。用酸堿調(diào)節(jié)pH沉淀樣品中蛋白的前處理是后期混合型強(qiáng)陰離子交換固相萃取凈化較好的選擇。

2.3 固相萃取的選擇與優(yōu)化

由于嬰幼兒配方食品和乳粉中各種成分復(fù)雜，其中水溶性成分的干擾目標(biāo)物檢測(cè)的雜質(zhì)繁多，用普通的C18固相萃取，很難將雜質(zhì)凈化干凈。香蘭素及其衍生物均帶有酚羥基，是弱酸性有機(jī)化合物，易失去 H+而變成陰離子，混合型強(qiáng)陰離子交換固相萃取對(duì)該類化合物具有更高的選擇性。上樣后一些雜質(zhì)也被保留下來(lái)，為了達(dá)到凈化的目的，必須把這些雜質(zhì)除去。在把這些雜質(zhì)除去的時(shí)候，不讓被測(cè)組分流失，先用堿性溶液沖洗萃取柱，讓被測(cè)組分全部以陰離子的形式存在，更好地被保留。而堿性溶液濃度不能太大，堿性也不能太強(qiáng)，否則會(huì)適得其反，故選擇了5%氨水溶液。再用甲醇淋洗，由于被測(cè)組分與萃取柱中的固定相因離子間的相互作用而被保留，大部分脂溶性的雜質(zhì)就被洗脫除去了。要將被測(cè)組分從柱子上洗脫下來(lái)，得用酸性比被側(cè)組分強(qiáng)的溶液。為了便于濃縮吹干，選用甲酸甲醇溶液進(jìn)行洗脫，將能中和分析物的電荷，使之從固相萃取柱上脫離下來(lái)。甲酸的濃度越大，洗脫效率就越高，但越不便于濃縮吹干。經(jīng)試驗(yàn)5%甲酸甲醇溶液洗脫效率最高，而且也容易濃縮吹干，保證了回收率。

2.4 方法的線性及檢出限

分別配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在最佳色譜條件下，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，得到4種化合物的回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍，并以3倍信噪比時(shí)的進(jìn)樣濃度計(jì)算出了檢出限，如表1所示。

2.5 方法的回收率及精密度

以同一個(gè)乳粉樣品為試驗(yàn)材料，加入一定量的香蘭素及其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，以平均值計(jì)算回收率，回收率結(jié)果如表3所示。

表1 線性關(guān)系與檢出限

表2 方法的回收率(n=3)

另外以同一個(gè)乳粉樣品為試驗(yàn)材料，添加了0.3 g香蘭素，0.5 g乙基香蘭素，0.8 g鄰位香蘭素，平行測(cè)定8次，測(cè)定結(jié)果的精密度 (n=8)分別為:香蘭素2.53%。乙基香蘭素2.09%，鄰位香蘭素4.18%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。由此可見(jiàn)，測(cè)定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好。

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)研究和優(yōu)化了流動(dòng)相和固相萃取條件，建立了高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方食品和乳粉中香蘭素及衍生物的方法。該方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好，靈敏度高，簡(jiǎn)單易操作，適合嬰幼兒配方食品和乳粉中香蘭素及衍生物的日常檢測(cè)。

[1]NI Y N,ZHANG G W,KOKOT S.Simultaneous Spectrophotometric Determination of Maltol,Ethyl Maltol,Vanillin and Ethyl Vanillin in Foods by Multivariate Calibration and Artificial Neural Net-works[J].Food Chem,2005,89:465-473.

[2]GB 2760-2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011.

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