黃曉林，宋戈

(1.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶163000；2.東北農業(yè)大學 國家乳制品質量監(jiān)督檢驗中心，哈爾濱150028)

0 引 言

香蘭素是一種合成香精，通常分為香蘭素和乙基香蘭素，還有鄰位香蘭素，具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香。人體大量攝入香蘭素等食品添加劑會導致頭暈、惡心、嘔吐,還會影響肝臟、腎臟的功能[1]。食品添加劑使用標準[2]中明確規(guī)定規(guī)定了較大嬰兒和幼兒配方食品中香蘭素使用限量,嬰幼兒谷類輔助食品中也可以使用香蘭素，但0至6個月嬰幼兒配方食品不得添加任何食用香料。目前，尚無嬰幼兒配方食品中香蘭素及衍生物的官方檢測方法，文獻報道的測定方法有高效液相色譜法[3]、氣相色譜[4-5]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[6-8]等，這些方法或靈敏度低，或操作繁瑣，或對設備要求高。本文采用高效液相色譜紫外檢測法同時測定了嬰幼兒配方食品和乳粉中香蘭素及衍生物的含量,方法簡單、快速,靈敏度高，重現(xiàn)性好，在實際樣品應用中得到了滿意結果。

1 實 驗

1.1 儀器設備

Waters2695高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器，酸度計,漩渦振蕩器,超聲提取儀。

1.2 試劑

香蘭素、乙基香蘭素和鄰位香蘭素標準品(≥98%)，用乙腈配置成質量濃度為1.0 g/L的儲備液，使用前用水稀釋到所需的質量濃度；乙腈，甲醇均為色譜純；磷酸二氫鉀，醋酸銨等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，柱溫為20℃；檢測器為紫外檢測器；測定波長為276 nm；流動相為濃度0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH=4.0)-乙腈(體積比為75∶25)；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min。

1.3.2 樣品處理

谷類輔助食品：稱量2～4 g到三角瓶中，加入0.5 g淀粉酶和40℃以下的水25 mL，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。乳粉：稱量2～4 g到三角瓶中；加入40℃以下的水25 mL溶解，旋渦振蕩1 min，冰水浴超聲10 min；然后用鹽酸溶液調pH值至1.7,用氫氧化鈉調pH值至4.5，定容到50 mL，搖勻后用濾紙過濾，吸取10 mL濾液到三角瓶中，用氫氧化鈉溶液調pH值至7，分多次洗入已經活化過的MAX固相萃取柱,依次用5%氨水3 mL、甲醇3 mL淋洗,再用4%甲酸甲醇溶液3 mL洗脫,在40℃下吹干后用流動相定容到1 mL,旋渦振蕩溶解后用0.45 m濾膜過濾,供分析測定。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在滿足分離效果，達到待測物質與雜質基本分離的條件下，應選擇能改善待測物質的響應，提高靈敏度的流動相。通過試驗發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸鹽溶液作流動相時待測物質分離度和靈敏度比甲醇-磷酸鹽溶液作流動相時高，而且系統(tǒng)壓力小。本實驗還考察了乙酸銨、硫酸銨和檸檬酸銨等溶液作為緩沖溶液時對分離測定的影響，結果顯示，乙腈-磷酸鹽溶液作流動相時分離效果和待測物質靈敏度都比較理想。另外通過改變流動相中緩沖溶液的濃度與pH值比較被測組分的色譜峰和分離度，確定流動相的緩沖溶液的濃度與pH值。當磷酸鹽溶液的濃度為分別為0.01，0.02，0.05，0.10 mol/L時，對分離影響不大，但隨著磷酸鹽溶液濃度的增加，待測物質的出峰時間愈穩(wěn)定，考慮到緩沖鹽濃度增大，對色譜柱及系統(tǒng)管路造成的損害也會加大，所以選擇濃度為0.05 mol/L的磷酸鹽溶液作為緩沖溶液。調節(jié)濃度為0.05 mol/L磷酸鹽溶液pH值分別為 5.0，4.5，4.0，3.5，3.0；隨著磷酸鹽溶液pH值的降低，峰形越來越對稱而且尖銳，重復性也越來越好，考慮到色譜柱的耐酸程度，調節(jié)濃度為0.05 mol/L磷酸鹽溶液pH值為4.0較為合適。為了縮短分析時間，通過試驗最終確定濃度為0.05 mol/L磷酸鹽溶液與乙腈的比例為75比25。標準樣品、含香蘭素及其衍生物樣品、空白樣品的色譜如圖1～圖3所示。按出峰順序依次為甲基香蘭素、乙基香蘭素和鄰位香蘭素。

圖1 標準樣品的色譜

圖2 含香蘭素及其衍生物樣品的色譜

圖3 空白樣品的色譜

2.2 前處理的選擇

前期處理的選擇與后期固相萃取凈化濃縮息息相關。除去樣品中蛋白質和脂肪的方法有很多，例如用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復合沉淀劑，用有機試劑甲醇和乙腈沉淀，加入堿和硫酸銅沉淀，用酸堿調節(jié)pH沉淀等等。進行樣品的凈化時，樣品溶液的pH值要大于香蘭素及其衍生物的pKa兩個單位，使其以陰離子的形式存在，上樣時才能萃取柱被保留。前期處理時選擇用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復合沉淀劑或加入堿和硫酸銅沉淀樣品中的蛋白，過濾后取部分濾液調整pH值到7時，有沉淀出現(xiàn)影響萃取凈化；而用有機試劑甲醇和乙腈沉淀，取部分濾液調整pH值到7后上樣由于溶液中有機相比例大，會穿透萃取柱，造成被測物流失。用酸堿調節(jié)pH沉淀樣品中蛋白的前處理是后期混合型強陰離子交換固相萃取凈化較好的選擇。

2.3 固相萃取的選擇與優(yōu)化

由于嬰幼兒配方食品和乳粉中各種成分復雜，其中水溶性成分的干擾目標物檢測的雜質繁多，用普通的C18固相萃取，很難將雜質凈化干凈。香蘭素及其衍生物均帶有酚羥基，是弱酸性有機化合物，易失去 H+而變成陰離子，混合型強陰離子交換固相萃取對該類化合物具有更高的選擇性。上樣后一些雜質也被保留下來，為了達到凈化的目的，必須把這些雜質除去。在把這些雜質除去的時候，不讓被測組分流失，先用堿性溶液沖洗萃取柱，讓被測組分全部以陰離子的形式存在，更好地被保留。而堿性溶液濃度不能太大，堿性也不能太強，否則會適得其反，故選擇了5%氨水溶液。再用甲醇淋洗，由于被測組分與萃取柱中的固定相因離子間的相互作用而被保留，大部分脂溶性的雜質就被洗脫除去了。要將被測組分從柱子上洗脫下來，得用酸性比被側組分強的溶液。為了便于濃縮吹干，選用甲酸甲醇溶液進行洗脫，將能中和分析物的電荷，使之從固相萃取柱上脫離下來。甲酸的濃度越大，洗脫效率就越高，但越不便于濃縮吹干。經試驗5%甲酸甲醇溶液洗脫效率最高，而且也容易濃縮吹干，保證了回收率。

2.4 方法的線性及檢出限

分別配制不同濃度的標準混合溶液，在最佳色譜條件下，進行了標準曲線的測定，得到4種化合物的回歸方程及線性相關系數、線性范圍，并以3倍信噪比時的進樣濃度計算出了檢出限，如表1所示。

2.5 方法的回收率及精密度

以同一個乳粉樣品為試驗材料，加入一定量的香蘭素及其衍生物的標準溶液，進行回收試驗，每個樣品平行測定3次，以平均值計算回收率，回收率結果如表3所示。

表1 線性關系與檢出限

表2 方法的回收率(n=3)

另外以同一個乳粉樣品為試驗材料，添加了0.3 g香蘭素，0.5 g乙基香蘭素，0.8 g鄰位香蘭素，平行測定8次，測定結果的精密度 (n=8)分別為:香蘭素2.53%。乙基香蘭素2.09%，鄰位香蘭素4.18%(均為質量分數)。由此可見，測定結果的較為穩(wěn)定，方法的重復性較好。

3 結 論

本文重點研究和優(yōu)化了流動相和固相萃取條件，建立了高效液相色譜法測定嬰幼兒配方食品和乳粉中香蘭素及衍生物的方法。該方法測定結果重現(xiàn)性好，靈敏度高，簡單易操作，適合嬰幼兒配方食品和乳粉中香蘭素及衍生物的日常檢測。

[1]NI Y N,ZHANG G W,KOKOT S.Simultaneous Spectrophotometric Determination of Maltol,Ethyl Maltol,Vanillin and Ethyl Vanillin in Foods by Multivariate Calibration and Artificial Neural Net-works[J].Food Chem,2005,89:465-473.

[2]GB 2760-2011食品安全國家標準食品添加劑使用標準[M].北京:中國標準出版社,2011.

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[4]林靈超,吳方圓.高效液相色譜法同時測定牛奶中的香蘭素與乙基香蘭素[J].化學分析計量,2013,22(2):60-62.

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