黃媛媛 馬宏 賈振華 黃亞麗 宋水山 張霞

（1.河北省科學院生物研究所，石家莊 050081；2.河北省主要農作物病害微生物控制工程技術研究中心，石家莊 050081）

農業(yè)生產中由害蟲造成的損失占農作物總損失的15%以上，因此對害蟲的防治是農業(yè)生產中的一項重要任務。傳統(tǒng)的害蟲防治主要為化學防治，但長期使用化學農藥會影響人類健康并對環(huán)境造成污染。而生物農藥以其簡便有效，對環(huán)境和生物安全的優(yōu)點，引起了世人的高度重視［1]。目前蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是世界上研究最為深入、應用面最廣的殺蟲微生物。但在實際應用中由于長期使用Bt，使得多種害蟲對Bt產生了抗性，其中夜蛾科害蟲粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）對Bt制劑產生抗性的防治尤為棘手［2]。群體感應（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)是指細菌細胞根據(jù)密度變化進行基因表達調控的生理行為［3]，群體感應參與多種生物學功能調節(jié)，如調控細菌毒性因子產生、抗生素合成、生物膜形成等［4]，調節(jié)植物生長、提高植物抗病性、對耐非生物脅迫中的作用等［5]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)昆蟲中腸細菌也具有群體感應現(xiàn)象，2007年，Guan 等［6]鑒定了來自舞毒蛾幼蟲中腸免培養(yǎng)細菌的信號分子合成基因，該研究屬首次從免培養(yǎng)細菌中鑒定新的群體感應誘導子類別。之后，Borlee等［7]研究了菜粉蝶幼蟲中腸土著微生物和致病微生物產群體感應信號分子的情況，該研究證實在菜粉蝶幼蟲的堿性腸道環(huán)境中細菌之間的信號分子AHL是可以進行交流的，并且有利于PAO1的致病性。粉紋夜蛾作為昆蟲中腸防御體系研究最為深入的昆蟲，主要集中在中腸圍食膜蛋白結構和Bt殺蟲蛋白受體方面，而對粉紋夜蛾中腸微生物群體感應的研究尚未見系統(tǒng)報道。

從細菌群體感應現(xiàn)象出發(fā)，探索粉紋夜蛾中腸中產信號分子的微生物與Bt殺蟲劑的相互作用，是強化Bt的殺蟲作用、增強害蟲生物防治效果的一個新途徑，具有重要的理論和實際意義。本研究從粉紋夜蛾中腸中進行產群體感應信號分子菌株的篩選，通過形態(tài)觀察，生理生化鑒定和分子生物學鑒定來確定該菌的種屬，并分析其產生信號分子的種類。該研究的進行對明確和闡明粉紋夜蛾中腸細菌群體感應系統(tǒng)對Bt殺蟲活性的可能作用與分子機理，有望為提高生物殺蟲劑防效和預防害蟲對生物殺蟲劑的抗性提供新的途徑與新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026由本實驗室保存，pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司，粉紋夜蛾幼蟲由河北農業(yè)大學郭巍教授實驗室提供，信號分子標準品（C6-HSL、3O C6-HSL）購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 粉紋夜蛾中腸微生物菌株分離 選取健康粉紋夜蛾幼蟲3條，殺死后75 %的酒精中消毒10 s、0.1% 升汞液中消毒2 min，滅菌水沖洗3次，之后在無菌條件下解剖出中腸組織研磨，采用梯度稀釋法將研磨液稀釋至1×10-6、1×10-7、1×10-8，并吸3個濃度的稀釋液各100 μL分別涂布于LB平板中，各稀釋度重復3 次，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，觀察記錄菌株生長情況，然后挑取菌落形態(tài)差異明顯的菌落，依次編號并進行多次純化，得到單菌落后LB試管保存?zhèn)溆茫?]。

1.2.2 產AHLs群體感應信號分子菌株的篩選 將過夜培養(yǎng)的報告菌CV026與50 mL 含有1.5%瓊脂的LB 培養(yǎng)基混合，倒平板。在平板底部畫出十字方格，將保存的從粉紋夜蛾消化道中分離出來的不同菌株用牙簽點接在每個方格中，30℃恒溫培養(yǎng)，定時觀察各個菌株的生長及產生色素情況，如果菌株周圍產生紫色則初步確定該菌株為產生信號分子的菌株。

1.2.3 菌落及菌體形態(tài)觀察 將篩選出來的產信號分子的菌株劃線接種到LB固體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察并記錄LB培養(yǎng)基上出現(xiàn)的單菌落形態(tài)。挑取單菌落的菌體進行Gram染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形狀、染色、產芽孢等情況［9]。

1.2.4 微生物菌株的16S rDNA擴增及擴增片段的測序 將產AHLs信號分子的菌株接種到LB培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)，離心獲得菌體后采用天根基因組DNA小提試劑盒提取基因組DNA。以提取的細菌DNA 作為模板，以16S rDNA通用引物：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和II：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'為引物對進行PCR擴增，PCR反應體系為（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，rTaq 0.2 μL，模板 1 μL，上下游引物各1 μL，滅菌雙蒸水12.8 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應結束后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將擴增正確的PCR產物送上海生工生物技術有限公司測序。

1.2.5 菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株的16S rDNA測序結果輸入到GenBank中，用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進行比較，利用Clustal 軟件進行多序列比對并計算進化距離，采用Mega 5.2 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.2.6 菌株生理生化反應測定 基于細菌的16S rDNA分子生物學方法鑒定的初步結果，參考伯杰氏細菌鑒定手冊，進行蒙氏腸球菌特異性生理生化反應，包括運行性測定液體基礎培養(yǎng)基、耐鹽性試驗、是否產H2S、不同糖類利用情況、乙酰甲基甲醇試驗（V-P試驗）、甲基紅試驗（M.R試驗）、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗測定等，進行細菌生理生化鑒定［10]。

1.2.7 信號分子的提取及鑒定 將產AHLs菌株接種到LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，菌液5 000 r/min離心3 min，吸取上清液后加入等體積二氯甲烷進行萃取，將有機相旋轉蒸發(fā)后重溶于1 mL乙腈中，即得到信號分子樣品。用微量移液器將4 μL樣品點在C18反相薄層板上，用甲醇水（6040，V/V）的展開劑展開，充分展開后蒸發(fā)溶劑，用混有C. violaceum026檢測菌株的軟瓊脂覆蓋在薄層板上，30℃過夜培養(yǎng)后觀察試驗結果的顯色情況［11]。

2 結果

2.1 產群體感應信號分子菌株的分離

通過稀釋涂平板的方法從粉紋夜蛾中腸中共分離出細菌120株，將這些菌株為備用菌株進行產信號分子菌株的篩選。

產AHLs信號分子菌株的分離采用平板篩選法，用的報告菌為Chromobacterium violaceumCV026，通過該方法，從120株菌株分離出2株產信號分子的菌株（圖1），菌株編號分別為Tni-9和Se-9。

圖1 產群體感應信號分子的菌株篩選結果

2.2 產群體感應信號分子菌株的鑒定

2.2.1 菌株的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征 將菌株Tni-9和Se-9接種在LB平板上，30℃培養(yǎng)48 h觀察其菌落形態(tài)，Tni-9和Se-9菌落近圓形，邊緣嚙蝕狀，顏色為乳白色，表面光滑無光澤不透明。將菌株Tni-9和Se-9進行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察其形態(tài)為圓形或卵圓形，單個或成對排列且革蘭氏染色為陽性（圖2，圖3）。

圖2 Tni-9顯微鏡下鏡檢照片（100ⅹ）

圖3 Se-9顯微鏡下鏡檢照片（100ⅹ）

2.2.2 菌株Tni-9、Se-9的16S rDNA基因鑒定 擴增菌株Tni-9、Se-9的16S rDNA基因得到一條明亮的特異條帶，長約1 500 bp（圖4）。獲得了Tni-9、Se-9菌株16S rDNA 核酸序列（GenBank登錄號分別為：KF551916，KF551917）。根據(jù)16S rDNA序列對Tni-9、Se-9相近物種進行聚類分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，結果（圖5）表明Tni-9、Se-9的16S rDNA序列與蒙氏腸球菌的序列同源性最近，初步鑒定這兩個菌株屬于蒙氏腸球菌。

圖4 菌株Tni-9、Se-9 16s rDNA-PCR 電泳圖

2.2.3 菌株的生理生化特征鑒定 根據(jù)上述的分子鑒定結果選取菌株Se-9進行菌株的生理生化檢測，結果如表1所示，菌株Se-9可發(fā)酵的碳水化合物種類廣泛，接觸酶陰性，在6.5% NaCl中可以生長，V-P反應陽性。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定菌株Se-9為蒙氏腸球菌。

圖5 Tni-9和Se-9的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

表1 Se-9主要生理生化特性

2.3 菌株Se-9產信號分子種類的確定

以3OC6-HSL和C6-HSL標準樣品為對照進行薄層層析，分析Se-9菌株產生信號分子的種類，由圖6可以看出兩個菌株在3OC6-HSL和C6-HSL標準樣品所在的相應位置都出現(xiàn)了一個紫色斑點，說明該菌株產生3OC6-HSL和C6-HSL兩種信號分子。

3 討論

圖6 菌株產信號分子種類的薄層層析分析

昆蟲腸道棲息著大量的微生物。隨著近年來研究腸道微生物的方法不斷進步，尤其是基于16S rDNA的分子生物學方法的應用，人們對腸道微生物的了解逐漸加深。腸道微生物對昆蟲寄主的作用包括提供營養(yǎng)、利用拓殖抗性抵抗外來微生物侵襲、參與多重營養(yǎng)關系、引起昆蟲免疫反應等。粉紋夜蛾是昆蟲中腸防御體系研究最為深入的昆蟲，但主要集中在中腸圍食膜蛋白結構和Bt殺蟲蛋白受體方面，對農業(yè)上重要害蟲粉紋夜蛾中腸微生物群體感應的研究尚未見系統(tǒng)報道。本研究從粉紋夜蛾中腸中分離出120個菌株，再利用luxI/luxRQS 系統(tǒng)的微生物傳感菌紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026分離出兩株可以產信號分子的菌株Tni-9和Se-9。對這兩個菌株進行了生理生化分析，通過16S rDNA擴增得到一條大小為1 500 bp左右的條帶。在NCBI基因庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)這兩個菌株與蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtiiATCC 43186）的16S rDNA核酸序列同源性最高達到99%。將測序結果用BLAST軟件與GenBank 中的相關屬種的16S rDNA序列進行比對，以大腸桿菌為外群，用Mega5.2 軟件構件系統(tǒng)發(fā)育樹。100次比對中98次都與蒙氏腸球菌聚合到同一個分支，鑒定這兩個菌株屬于蒙氏腸球菌。提取菌株Se-9所產生的信號分子，通過薄層層析與微生物傳感菌相結合的方法對菌株產生的信號分子進行定性分析，結果顯示Se-9可以產生兩種信號分子C6-HSL和3OC6-HSL。該菌株的獲得，為下一步利用轉座子標簽技術構建群體感應缺失突變體，并在缺少及富含該產信號分子菌株條件下測定昆蟲的殺蟲活性奠定基礎（本試驗正在進行中）。整個研究的目的是以粉紋夜蛾為研究對象，將細菌群體感應系統(tǒng)和昆蟲中腸防御體系聯(lián)系起來，探索群體感應系統(tǒng)對微生物殺蟲活性影響，為農業(yè)生產中昆蟲生物防治提供理論依據(jù)和新的思路。

4 結論

從粉紋夜蛾中腸中分離出120個菌株，采用群體感應報告菌株CV026進行復篩，分離出兩株可以產信號分子的菌株Tni-9和Se-9。對這兩株菌進行形態(tài)學分析、16S rDNA 鑒定及生理生化分析，鑒定這兩株菌為蒙氏腸球菌。提取Se-9的信號分子，通過薄層層析分析顯示Se-9可以產生兩種信號分子C6-HSL和3OC6-HSL。

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