胡泓宇 周燕燕 陳靜 侯運(yùn)華

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353）

阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，F(xiàn)AE）又稱肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯鍵，將阿魏酸釋放出來，屬于羧酸酯水解酶亞類［1]。該酶可以協(xié)同木聚糖酶、纖維素酶和木質(zhì)素酶最大程度降解植物細(xì)胞壁［2]。因此，阿魏酸酯酶在食品、醫(yī)藥、造紙、飼料加工、生物合成及能源開發(fā)等諸多領(lǐng)域都有著巨大的應(yīng)用潛能。

產(chǎn)生阿魏酸酯酶的來源極其廣泛，在微生物、植物和動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)，其中以細(xì)菌和絲 狀真菌的來源為主。產(chǎn)阿魏酸酯酶的細(xì)菌多為厭氧營養(yǎng)型，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此關(guān)于絲狀真菌產(chǎn)阿魏酸酯酶的研究就顯得十分重要［2，3]。絲狀真菌產(chǎn)阿魏酸酯酶的研究主要集中在曲霉屬，以黑曲霉研究得最為清楚。通常絲狀真菌產(chǎn)阿魏酸酯酶活力較低，如de Vries等［4]報(bào)道重組黑曲霉和塔賓曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶活力分別為7.71 U/mL和3.16 U/mL。關(guān)于側(cè)孢霉和黑曲霉生產(chǎn)阿魏酸酯酶研究比較多。側(cè)孢霉液態(tài)發(fā)酵酶活達(dá)到2.0 mU/mL，固態(tài)發(fā)酵酶活達(dá)到156 mU/g［5]。阿魏酸酯酶活力低下限制了其在工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。

鏈隔孢屬真菌是引起農(nóng)作物病害的重要致病真菌之一，屬于絲孢綱絲孢目。對該類真菌的研究主要集中在致病機(jī)理和生物防治方面［6]，該菌產(chǎn)生阿魏酸酯酶的報(bào)道較少［7]。多數(shù)絲狀真菌產(chǎn)阿魏酸酯酶已經(jīng)被國外酶制劑公司申請專利，要進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用就需要篩選新的產(chǎn)酶菌株?；诖耍驹囼?yàn)通過對腐爛木質(zhì)纖維的土壤樣品中分離的產(chǎn)阿魏酸酯酶絲狀真菌進(jìn)行篩選，得到1株產(chǎn)阿魏酸酯酶活性高的菌株，對該菌株進(jìn)行了菌種形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，并對其所產(chǎn)阿魏酸酯酶的粗酶性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品材料 土樣采集自山東濟(jì)南長清周邊含有腐爛木質(zhì)纖維（5-15 cm）的土壤。

1.1.2 化學(xué)試劑 對硝基苯酚、阿魏酸乙酯購自Sigma公司。凝膠回收試劑盒、pUM-T載體購自百泰克生物技術(shù)公司。T4DNA連接酶購自TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶、pfuDNA聚合酶為Bioteke公司的產(chǎn)品，DNA凝膠回收試劑盒購自Sangon公司；阿魏酸對硝基苯酚酯根據(jù)文獻(xiàn)一步法合成［8]；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）［9]，0.1% 阿魏酸乙酯（溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液，過濾除菌）。

篩選培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.6%，CaC120.07%，酵母粉0.5%，0.02%TritonX-100，瓊脂1.5%。每個(gè)平板倒20 mL篩選培養(yǎng)基，立即加300 μL 的10%（W/V）阿魏酸乙酯中，立即搖勻，直至呈現(xiàn)云霧狀。28℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落周圍有無透明圈。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥麩汁 10%，NH4NO30.28%，KH2PO40.2%，MgSO4.7H2O 0.08%，NaNO30.31%，pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的篩選 準(zhǔn)確稱取1 g土樣，加入100 mL含有無菌玻璃珠的生理鹽水中，振蕩培養(yǎng)2 h，即為土壤浸提液。取1 mL浸提液液接種于富集培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，置于28℃下200 r/min搖床培養(yǎng)2 d。梯度稀釋（10-1-10-6）培養(yǎng)物，各稀釋度取100 μL涂布于PDA平板上，28℃培養(yǎng)4 d，觀察平板，菌落周圍出現(xiàn)透明圈的即為具有產(chǎn)阿魏酸酯酶能力的菌株。挑取有透明圈的菌落于5 mL生理鹽水試管中，制備孢子懸浮液，梯度稀釋后涂布在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。重復(fù)3次后的單菌落認(rèn)為是純化的菌株。根據(jù)透明圈直徑大小進(jìn)行初篩，通過初篩的菌株液體培養(yǎng)后測上清阿魏酸酯酶活進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.2 菌株的形態(tài)觀察 按照《真菌鑒定手冊》，將純化的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，觀察菌落外觀形態(tài)和菌絲生長情況；顯微鏡高倍鏡下觀察菌絲體和分生孢子的形態(tài)。

1.2.3 菌株的18S rDNA和ITS分子鑒定 將菌株斜面孢子接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)72 h，過濾收集菌絲體，采用液氮研磨法［10]提取其染色體DNA。

待測菌株的18S rDNA基因是以染色體DNA為模板，在18S rDNA通用引物（EF3和EF4）的介導(dǎo)下，采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物的序列如下：

EF3：5'-TCCTCTAAATGGT-GACCAAGTTTG-3'，

EF4：5'-GGAAGGG［G/A] TG-TATTTATTAG-3'。

PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 1 min 40 s，28個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

待測菌株的ITS序列是在通用引物（ITS4和ITS86）的介導(dǎo)下，采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物的序列如下：

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，

ITS86：5'-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3'。

PCR擴(kuò)增程序除了退火溫度為50℃外，其余步驟與18S rDNA的相同。

將18S rDNA和ITS PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。按照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，然后委托濟(jì)南力戈生物公司直接進(jìn)行測序。

1.2.4 序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測序后將序列提交NCBI GenBank進(jìn)行序列同源性分析，并利用Mega5.2軟件［11]進(jìn)行18S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.5 阿魏酸酯酶粗酶液的制備及酶活測定 取1 mL發(fā)酵液于4℃，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。阿魏酸酯酶的酶活測定方法采用分光光度法［12]測定，將反應(yīng)條件下，每分鐘降解阿魏酸對硝基苯酚酯生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

1.2.6 溫度和pH對阿魏酸酯酶粗酶液活性的影響

1.2.6.1 粗酶液最適溫度及溫度穩(wěn)定性 分別在不同溫度下（30-70℃）測定阿魏酸酯酶活性。以最高酶活為100%，計(jì)算其他溫度下的相對酶活，繪制溫度—相對酶活曲線。將粗酶液分別置于45、55和65℃保溫60 min，測定殘余酶活性，繪制不同溫度下相對酶活—溫育時(shí)間曲線。

1.2.6.2 粗酶液最適pH及pH穩(wěn)定性 將粗酶液在不同pH（pH3.0-7.5）條件下測阿魏酸酯酶的活性。與溫度類似，繪制相對酶活隨pH變化的曲線。將粗酶液用不同pH值緩沖液（pH3.5-7.5的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液）稀釋，于35℃下保溫1 h，測定殘余酶活。以其中酶活性最高者為100%，其他pH值下與該酶活的比值為該pH值下的相對酶活，繪制相對酶活—pH曲線。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)阿魏酸酯酶絲狀真菌的篩選

利用平板透明圈法，從含有腐爛木質(zhì)纖維的土壤中篩選分離到37株絲狀真菌，其中1株透明圈直徑較大，將其編號為HA4087，如圖1。該菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后收集上清，測得發(fā)酵液上清中阿魏酸酯酶活性為86 mU/mL。

圖1 菌株HA4087在篩選平板上形成的透明圈（背面）

2.2 產(chǎn)阿魏酸酯酶絲狀真菌的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 菌株HA4087生長迅速，菌絲蔓延速度快，在PDA培養(yǎng)基上28℃ 培養(yǎng)4 d后，即可鋪滿整個(gè)平板。生長初期菌絲為白色絨毛狀，后期菌絲為灰黑色，菌落高聳突起，呈棉絨狀。該菌在生長過程中向培養(yǎng)基中分泌色素，因此平板背面呈藍(lán)黑色（圖1）。對HA4087的菌絲體和分生孢子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了顯微觀察，結(jié)果如圖2所示。該菌株的菌絲透明，有隔膜。菌絲頂端形成分生孢子。分生孢子卵形，具有典型橫隔膜，呈磚格狀分隔（圖2-B），根據(jù)分生孢子的形態(tài)特征初步認(rèn)為該菌屬于鏈格孢菌。

圖2 菌株HA4087的菌絲和分生孢子形態(tài)（16×40）

2.2.2 菌株分子鑒定 對菌株HA4087分別進(jìn)行18S rDNA和ITS序列的克隆，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶單一且明亮，產(chǎn)物大小與預(yù)期吻合，初步表明18S rDNA和ITS序列已經(jīng)克隆得到。PCR產(chǎn)物回收后，進(jìn)行序列測定，測序（結(jié)果省略）顯示18S rDNA基因和ITS序列的PCR產(chǎn)物長度分別為1 561 bp 和783 bp。兩個(gè)基因序列已經(jīng)提交NCBI GenBank，編號分別為KF962959和KF962960。

圖3 菌株HA4087 18S rDNA（A）和ITS PCR（B）擴(kuò)增電泳圖

將克隆的18S rDNA基因序列輸入 GenBank 進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示其與Alternariasp.的相似性最高，達(dá)100%，初步鑒定其為鏈格孢屬。并與其他同源性高的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖4所示。HA4087 與Alternaria alternata的相似性達(dá) 99%，結(jié)合該菌的形態(tài)特征確定該菌屬于鏈格孢屬。

將克隆的ITS序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示其與A. alternata的相似性為100%。結(jié)合該菌的形態(tài)特征及18S rDNA序列，確定所分離的菌株為互隔交鏈格孢霉。

圖4 菌株HA4087的18S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 粗酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 溫度對酶活力和穩(wěn)定性的影響 分別在30-70℃測定粗酶液的活力，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，菌株HA4087阿魏酸酯酶最適反應(yīng)溫度為55℃，在50-60℃的范圍內(nèi)催化活性較高。將酶液在45-65℃之間保存一定時(shí)間，測定殘余酶活，結(jié)果（圖6）表明，溫度為45℃時(shí)，該酶穩(wěn)定，處理60 min后，剩余酶活仍能達(dá)到93.7%；當(dāng)溫度為55℃時(shí)，處理30 min后剩余酶活為90.1%，隨著溫育時(shí)間的延長，剩余酶活力下降較快；當(dāng)溫度達(dá)65℃時(shí)，保溫10 min，剩余酶活力僅為16.8%。

圖5 溫度對酶活力的影響

圖6 溫度對粗酶液穩(wěn)定性的影響

2.3.2 pH值對酶活力和穩(wěn)定性的影響 粗酶液在不同pH下測定酶活力，以pH作出相對酶活力曲線，結(jié)果（圖7）表明，菌株HA4087阿魏酸酯酶的最適反應(yīng)pH值為5.5。在pH5.0-7.0的范圍內(nèi)，酶活力保持較高水平（80%以上）。將酶液于pH3.5-7.5中溫育60 min后測定剩余酶活力，結(jié)果（圖8）表明，該酶在pH4.5-6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定，殘余酶活接近85%。

圖7 pH值對酶活力的影響

圖8 pH值對酶穩(wěn)定性的影響

2.4 互隔交鏈格孢霉阿魏酸酯酶與其他絲狀真菌產(chǎn)酶性質(zhì)的比較

本研究將互隔交鏈格孢霉的阿魏酸酯酶性質(zhì)和黑曲霉、米曲霉、土曲霉和腐質(zhì)霉所產(chǎn)生的酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的比較（表1）。表1顯示，酶活高低次序是黑曲霉＞腐質(zhì)霉＞互隔交鏈格孢霉＞米曲霉和土曲霉?；ジ艚绘湼矜呙沟幕盍?6 mU/mL，比土曲霉和米曲霉的活力稍高，具有較強(qiáng)的酶活力。測定的酶活和Xiao等［7]報(bào)道的酶活一致。后續(xù)通過對培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化及對出發(fā)菌株誘變還能較大幅度提高酶的產(chǎn)量。酶的熱穩(wěn)定試驗(yàn)顯示HA4087菌株產(chǎn)生的酶具有良好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)在55℃溫育30 min仍能保留90%以上的酶活，該特性有助于在飼料工業(yè)中的應(yīng)用開發(fā)。pH穩(wěn)定性和其他來源的酶相比顯得稍弱，后續(xù)可以通過定向進(jìn)化來提高pH穩(wěn)定性。

表1 不同菌株產(chǎn)生的阿魏酸酯酶A的性質(zhì)比較

3 討論

阿魏酸酯酶是半纖維水解酶系中關(guān)鍵的一員，屬于輔助酶，能夠協(xié)同木聚糖酶和纖維素酶更好水解相應(yīng)的基質(zhì)［16，17]。本研究分離得到1株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的互隔交鏈孢霉HA4087，對該菌株所產(chǎn)阿魏酸酯酶的粗酶性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明該菌株產(chǎn)生的阿魏酸酯酶活性較強(qiáng)，并具有良好的熱穩(wěn)定性。這些特征表明互隔交鏈格孢菌所產(chǎn)的阿魏酸酯酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值。對其阿魏酸酯酶酶學(xué)性質(zhì)的測定將有助于該酶實(shí)際應(yīng)用參數(shù)的確定和優(yōu)化，尤其是對后續(xù)開展該菌阿魏酸酯酶的定向進(jìn)化和高效分泌表達(dá)的研究提供了前提和參考。

對互隔交鏈格孢霉HA4087的阿魏酸酯酶和其他絲狀真菌來源的酶進(jìn)行了性質(zhì)比較顯示該酶具有較好的應(yīng)用前景。不同絲狀真菌產(chǎn)生的阿魏酸酯酶產(chǎn)量和酶學(xué)性質(zhì)的不同可能是由目的基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度、mRNA穩(wěn)定性、分泌強(qiáng)弱、蛋白一級結(jié)構(gòu)和翻譯后糖基化修飾等造成［16，17]。令人疑惑的是，黑曲霉、黃曲霉和米曲霉的基因和蛋白序列的相似性達(dá)90%，但是酶活差異較大。此外，暗色孢屬真菌產(chǎn)阿魏酸酯酶的產(chǎn)生與其在植物組織中的強(qiáng)烈的蔓延性具有一定的相關(guān)性，這可能也是該菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶活高于其他常規(guī)絲狀真菌的活性。因此對其阿魏酸酯酶的研究不僅能為阿魏酸酯酶家族增加新的試驗(yàn)材料，還能加深暗色真菌侵染植物機(jī)制的理解。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從含有腐爛木質(zhì)纖維的土壤中篩選分離得到1株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的絲狀真菌HA4087，經(jīng)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為互隔交鏈孢霉。該菌株所產(chǎn)阿魏酸酯酶活力為86 mU/mL，最適反應(yīng)溫度為55℃，最適pH值為5.5；在55℃保溫30 min后酶活力仍為90%以上；在pH4.5-6.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，酶活仍為85%以上。

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