張園園

(安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 安康 725021)

蛹蟲草栽培中幾種細(xì)菌性病原菌分離與鑒定*

張園園

(安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 安康 725021)

利用16S rDNA序列分析的方法，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征及細(xì)菌生理生化鑒定，研究了蛹蟲草栽培過(guò)程中易導(dǎo)致病害的3種細(xì)菌。結(jié)果表明，病原菌株E1與Flavobacteriumchungangense，E2與Flavobacteriumchungangense，E3與Janthinobacteriumlividum的進(jìn)化距離較小，同源性較高，初步確定分別與其同種。這對(duì)蛹蟲草常見病害的防治研究具有重要的指導(dǎo)意義。

蛹蟲草；細(xì)菌性病原菌；分離；鑒定

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)，又名北冬蟲夏草，簡(jiǎn)稱北蟲草，屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、核菌綱(Pyrenomycetes)、麥角菌目(Clavicipitales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)真菌，與冬蟲夏草(Cordycepssineisis)同屬異種，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。大量研究表明，蛹蟲草中所含的活性成分蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等含量明顯高于冬蟲夏草，對(duì)提高人體免疫力，預(yù)防和治療高血糖、高血壓等多種疾病有顯著的作用[2]。因此，對(duì)蛹蟲草的開發(fā)研究越來(lái)越受到人們的重視。近年來(lái)，隨著對(duì)蛹蟲草的深入研究，蛹蟲草栽培技術(shù)已日趨成熟，但在生產(chǎn)中仍會(huì)出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)緩慢、子座分化不整齊或不分化及培養(yǎng)基有黏稠狀液體等現(xiàn)象，對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量影響較大。因此，本試驗(yàn)就引起以上現(xiàn)象的病原菌進(jìn)行分離與鑒定，以期為蛹蟲草常見病害的防治研究提供依據(jù)，也為完善蛹蟲草的栽培技術(shù)提供參考。

1 材料

1.1 樣品采集

分別采集在蛹蟲草栽培過(guò)程中被細(xì)菌污染的樣品4份。

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基(固體)：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉3 g、瓊脂粉12 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

細(xì)菌培養(yǎng)基(液體)：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉3 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離純化

采用平板稀釋涂布法，對(duì)樣品進(jìn)行分離純化。將4份樣品分別加入裝有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在30℃、200 r·min-1的條件下震蕩10 min，按10倍梯度稀釋法得到10-6倍～10-8倍稀釋液。各取0.5 mL稀釋液均勻涂布于平板上，每個(gè)梯度重復(fù)3次，將平板置于(25±1)℃條件下倒置培養(yǎng)，待平板長(zhǎng)出菌落后，分別挑取單菌落進(jìn)行劃線分離純化，直至獲得純的菌種，4℃保存待用。

1.3.2 致病性測(cè)定

將已分離純化的3個(gè)細(xì)菌菌株，分別挑取一環(huán)細(xì)菌置于細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，制備3種細(xì)菌懸浮液。當(dāng)蛹蟲草菌絲覆面后，分別接種細(xì)菌懸浮液10 mL·盒-1，設(shè)置無(wú)菌水對(duì)照。接種后進(jìn)行常規(guī)管理，并觀察蛹蟲草生長(zhǎng)情況。

1.3.3 菌落形態(tài)觀察

將分離到的細(xì)菌菌株分別置于(28±2)℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落特征，并進(jìn)行簡(jiǎn)單的染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.3.4 細(xì)菌生理生化鑒定

挑取細(xì)菌菌落，接種生化管，培養(yǎng)24 h～48 h，觀察分離菌株的生化特性。檢測(cè)項(xiàng)目包括甲基紅試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)。

1.3.5 菌株分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[3]。首先，采用快速微量提取法提取細(xì)菌基因組DNA，并將各菌株的DNA溶解于50 μL的TE中，-20℃保存?zhèn)溆?；其次，采用?xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物：27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)，反向引物：1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)。PCR反應(yīng)體系(50 μL) 27F 2 μL，1492R 2 μL，ExTaq 0.4 μL，2×Reaction mix 25 μL，ddH2O20.6 μL，DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，然后95℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序；將各個(gè)菌株基因序列運(yùn)用Blast程序與GenBank中已存在的菌株核酸序列進(jìn)行比較，選取相似性較高的序列進(jìn)行分析，使用MEGA5軟件中的BootstrapTest of Phylogeny-Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[4]，并參照菌株的形態(tài)特征和生理生化檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[5]，初步鑒定菌株的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化與保藏

根據(jù)形態(tài)特征從樣品中分離到3種菌株，分別編號(hào)為E1～E3。

2.2 致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果表明，在菌絲覆面后，重新接種3種不同的菌懸液，48 h后菌絲均表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象。培養(yǎng)36 h后對(duì)其進(jìn)行光照，結(jié)果如圖1～圖4所示。

圖1～圖4表明，菌株E1～E3均可不同程度地抑制蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢、無(wú)法正常轉(zhuǎn)色并形成原基，最終出現(xiàn)菌絲老化并自溶的現(xiàn)象。

2.3 菌株形態(tài)觀察

不同菌株菌落形態(tài)觀察結(jié)果見表1。

2.4 細(xì)菌生理生化鑒定

細(xì)菌E1～E3的生理生化鑒定結(jié)果見表2。

2.5 菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物

采用原核生物16S rDNA序列的通用引物27F、1492R對(duì)3株細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

表1 菌落形態(tài)觀察

結(jié)果表明，在1 500 bp處有3條DNA帶，表明分離的菌株均為原核生物類。

表2 細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果

注：+表示陽(yáng)性，-表示陰性。

2.6 序列比對(duì)和進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用NCBI網(wǎng)站，將E1～E3的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)菌株的序列進(jìn)行比對(duì)，并選取相似性較高的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見表3～表5和圖5～圖7。

2.6.1 E1菌株Blast比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

GenBank 上E1的部分相似菌株及E2系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹見表3、圖5。

表3 GenBank上E1的部分相似菌株

由表3可見，E1與Flavobacteriumchungangense的同源性最高，達(dá)98%；從圖5可以看出，E1與Flavobacteriumchungangense聚為一支，與其他菌株的差異相對(duì)較大。因此，綜合Blast和進(jìn)化發(fā)育樹的結(jié)果，初步確定E1與Flavobacteriumchungangense為同種。

2.6.2 E2菌株Blast比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

GenBank上E2的部分相似菌株及E2系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹見表4、圖6。

表4 GenBank上E2的部分相似菌株

由表4可見，E2與Pseudomonasasplenii的同源性最高，達(dá)100%；從圖6上可以看出，E2與Pseudomonasasplenii聚為一支，與其他菌株的差異相對(duì)較大。因此，綜合Blast和進(jìn)化發(fā)育樹的結(jié)果，初步確定E2與Pseudomonasasplenii為同種。

2.6.3 E3菌株Blast比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

GenBank上E3的部分相似菌株及E3系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹見表5、圖7。

表5 GenBank 上E3的部分相似菌株

由表5可見，E3與Janthinobacteriumlividum的同源性最高，達(dá)99%；從圖7上可以看出，E3與Janthinobacteriumlividum聚為一支，與其他菌株的差異相對(duì)較大。因此，綜合Blast和進(jìn)化發(fā)育樹的結(jié)果，初步確定E3與Janthinobacteriumlividum為同種。

3 結(jié)論與討論

本研究利用細(xì)菌的通用引物，提取各菌株的總DNA，采用PCR方法擴(kuò)增得到各菌株的序列。一般認(rèn)為，若同源性大于99%，則可認(rèn)為它們屬同一個(gè)種；若同源性小于98%，可認(rèn)為屬不同的種；同源性小于95%，可認(rèn)為屬不同的屬[6]。綜合各菌株形態(tài)特征、生理生化特性及進(jìn)化發(fā)育樹，參考常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)和真菌鑒定手冊(cè)，初步確定E1為Flavobacteriumchungangense，E2為Pseudomonasasplenii，E3為Janthinobacteriumlividum。根據(jù)這些菌株的特征，可從篩選抗病菌株、研制抑制劑等方面對(duì)蛹蟲草栽培中的病害進(jìn)行防治研究，這也為完善蛹蟲草栽培技術(shù)提供了重要依據(jù)。

[1]卯曉嵐. 我國(guó)常見食藥用菌名稱[J]. 中國(guó)食用菌，2002，21(4)：24-26.

[2]張平，朱述鈞，錢大順，等. 北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003(6)：105-107.

[3]魏群. 分子生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)(第二版)[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[4]奧斯伯，金斯頓，塞德曼，等. 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[5]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[6]Tejada AM, Garcia C, Gonzalez JL, et al. Use of organic amendment as a strategy for soil remediation: Influence on the physical, chemicial and biological properties of soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2006(38): 1413-1421.

Isolation and Identification of Several Kinds of Bacterial Pathogens inCordycepsmilitarisCultivation

ZHANG Yuan-yuan

(Agricultural and Science Research Institute of Ankang City, AnkangShanxi725021)

Using sequence analysis method of 16S rDNA, combining with morphological characteristics of bacterial, as well as, physiological and biochemical identification of bacteria, three bacterial, which caused disease in the cultivation ofCordycepsmilitariswere studied. The results showed that E1～E3 had high similarity withFlavobacteriumchungangense,Flavobacteriumchungangense,Janthinobacteriumlividum, respectively and speculated that it may be for their relatives. It had important guiding significance in preventing and controlling common disease on artificial cultivation ofCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris; Bacterial pathogens; Separation; Identification

*項(xiàng)目來(lái)源：陜西省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)業(yè)科技示范項(xiàng)目“秦巴山區(qū)特色食用菌產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)研究”(2011KTCL02-18)。

張園園(1987-)，女，助理農(nóng)藝師，主要研究方向?yàn)榍匕蜕絽^(qū)野生珍稀食、藥用菌人工馴化栽培及富硒產(chǎn)品開發(fā)研究。 E-mail: zhangyuanyuan405@163.com

2014-09-22

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0046-04