張 蓉，單 虎，劉 欣，張 軍

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1. 消化科；陜西西安 710004；2.心內(nèi)科，陜西西安 710004)

近年來，流行病學(xué)資料顯示，食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)的發(fā)病率呈快速增加的趨勢[1]，尤其在美國白人中，EAC已經(jīng)超越食管鱗癌成為食管癌最常見的組織學(xué)類型[2]。各種原因引起的酸和(或)膽酸等反流物反流至食管導(dǎo)致食管上皮慢性炎癥，持續(xù)存在的炎癥通過釋放大量化學(xué)趨化因子、細(xì)胞因子及活性氧(reactive oxygen species, ROS)等，促使食管上皮細(xì)胞增殖并最終誘導(dǎo)細(xì)胞突變[3]，這是目前普遍認(rèn)同的EAC發(fā)病機制。

然而，單獨抑酸治療并不足以預(yù)防胃食管反流病進(jìn)展為EAC[4]。因此，除酸外，膽酸在EAC的形成和進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用。人體中的膽酸主要包括膽酸(CA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)以及脫氧膽酸(deoxycholic acid, DCA)，其中以DCA的毒性作用最強。DCA能引起食管上皮細(xì)胞活性下降及誘導(dǎo)慢性炎癥發(fā)生[5]，常作為腫瘤誘導(dǎo)劑用于EAC及其癌前病變的動物造模[6]。在EAC患者中，高濃度的膽酸通過釋放ROS發(fā)揮其細(xì)胞毒性及遺傳毒性作用，主要包括損傷細(xì)胞膜、線粒體膜及干擾細(xì)胞功能、造成DNA氧化損傷等[7]，從而誘導(dǎo)腫瘤形成并參與腫瘤的進(jìn)展，其次ROS也作為一個中間分子調(diào)節(jié)炎癥誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生和發(fā)展[8]。然而，DCA對EAC炎癥因子表達(dá)的影響以及可能的機制尚未見報道。本研究將探討DCA對EAC細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響，分析DCA調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)是否通過ROS途徑實現(xiàn)，為其發(fā)病機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人EAC OE19細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院消化科房殿春教授惠贈；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，重組人球形脂聯(lián)素(美國Peprotech公司)，重組人全長型脂聯(lián)素及ELISA檢測試劑盒(美國R&D Systems)，Trizol和ROS檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)，SYBR熒光染料檢測試劑盒(中國TaKaRa公司)，DCA(美國Sigma公司)，NAC(中國Wolsen公司)。

1.2體外細(xì)胞培養(yǎng)將人EAC OE19細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基及抗生素(100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素)中，于37 ℃、50 mL/L CO2及950 mL/L濕度條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗，所有實驗均重復(fù)3次。

1.3MTT分析細(xì)胞活性取對數(shù)生長期細(xì)胞，8×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80%，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，實驗組DCA終濃度為50、100、150、200、250、300 μmol/L，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基，每濃度每時間點重復(fù)5孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、3、6、12、24 h加5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃孵育3 h直到結(jié)晶紫出現(xiàn)，棄上清液。每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，搖床振蕩10 min，在492 nm波長酶標(biāo)儀上測各孔吸光度(A)值。按公式：細(xì)胞活性=DCA組A值均數(shù)/對照組A值均數(shù)×100%。

1.4Real-timePCR(RT-PCR)檢測TNF-α、IL-6和IL-8mRNA水平對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80%，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，在有或無NAC存在的情況下，DCA(終濃度為50、100、200、300 μmol/L)及空白對照組(等體積的培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)6 h。用Trizol試劑按說明提取細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA，在20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)合成cDNA。用合適的引物及SYBR Green熒光染料擴(kuò)增目的產(chǎn)物。TNF-α引物序列：上游引物5′-CCGTCTCCTACCAGACCAAGG-3′，下游引物5′-CTGGAAGACCCCTCCCAGATAG-3′；IL-8引物序列：上游引物5′-CCAAGGAGTGCTAAAGAACT-3′，下游引物5′-CTTCTCCACAACCCTCTG-3′；IL-6引物序列：上游引物5′-CACACAGACAGCCACTCACCTC-3′，下游引物5′-CTGCCAGTGCCTCTTTGCTG-3′；β-actin引物序列：上游引物5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′，下游引物5′-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3′。引物均由北京奧科生物公司合成。每組設(shè)置1個復(fù)孔，每個基因重復(fù)3次試驗。從擴(kuò)增曲線獲得Ct值，基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.5ELISA檢測TNF-α、IL-6和IL-8蛋白表達(dá)細(xì)胞接種于6孔板，藥物干預(yù)及培養(yǎng)時間同前。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液。用ELISA方法測定上清細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的水平，在450 nm波長酶標(biāo)儀上檢測樣品吸光度(A)值，根據(jù)樣品A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)TNF-α、IL-6和IL-8含量。

1.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平細(xì)胞接種于6孔板，在有或無NAC存在的情況下，采用不同濃度的DCA干預(yù)1 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 mL 10 μmol/L的熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, H2DCFDA)，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。2.5 g/L胰酶消化收集細(xì)胞后，用500 μL PBS重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測雙氯熒光素的熒光強度。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性的條件檢驗；采用多因素的方差分析方法分析濃度和時間對OE19細(xì)胞活性作用及兩者間的交互作用，采用單因素的方差分析方法分析不同濃度組細(xì)胞炎性細(xì)胞因子mRNA、蛋白水平以及ROS水平的差異，方差分析后兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DCA對OE19細(xì)胞活性的影響DCA對EAC細(xì)胞活性的影響受到作用濃度和作用時間的共同影響(P<0.001和P=0.002)，呈濃度依賴性及時間依賴性，隨著作用濃度及時間的增加，細(xì)胞活性明顯受到抑制(圖1)。DCA干預(yù)1 h后，不同濃度的DCA對細(xì)胞活性無明顯影響(P=0.067)。在3、12、24 h，低劑量的DCA(≤150 μmol/L)對細(xì)胞活性的影響與對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但是，與對照組相比，高劑量的DCA(≥200 μmol/L)作用6、12、24 h后，細(xì)胞活性明顯受到抑制(P<0.05)，尤其是作用12、24 h，細(xì)胞活性明顯下降了50%以上。此外，作用6 h后，高劑量DCA比低劑量DCA抑制細(xì)胞的活性更強(P<0.05)。因此，200 μmol/L的DCA作用6 h是其發(fā)揮生物學(xué)作用的初始濃度及有效時間。

圖1不同濃度DCA(μmol/L)對OE19細(xì)胞活性的影響

Fig.1 Effects of different doses of DCA (μmol/L) on viability of OE19 cells

2.2DCA對TNF-α、IL-6和IL-8mRNA水平的影響在OE19細(xì)胞中，DCA對TNF-α、IL-6 和IL-8 mRNA水平的影響是相似的，均呈現(xiàn)劑量依賴性(圖2)，與對照組相比，高劑量的DCA(200 μmol/L和300 μmol/L)明顯增加TNF-α(6倍和9倍，P=0.001，P<0.001)、IL-8(6倍和10倍，P<0.001，P<0.001)和IL-6(3倍和6倍，P=0.001，P<0.001)。相反，DCA<100 μmol/L對TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA水平的影響與對照組之間的差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.910，P=0.483，P=0.757)。與100 μmol/L DCA干預(yù)組相比，高劑量的DCA明顯增加TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA水平(P<0.05)。并且，NAC明顯抑制DCA誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α(1.9倍，P<0.001)、IL-8(2.2倍，P<0.001)和IL-6 mRNA水平(1.9倍，P=0.004)。

圖2DCA與NAC對EAC細(xì)胞炎癥因子mRNA的影響

Fig.2 Effects of DCA or/and NAC on the mRNA level of EAC inflammatory factors in OE19 cells

與對照組相比，*P<0.05；與低劑量DCA(≤100 μmol/L)相比，#P<0.05；與200 μmol/L DCA相比，**P<0.05。

2.3DCA對TNF-α、IL-6和IL-8蛋白水平的影響DCA明顯增加TNF-α和IL-8蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)劑量依賴性(表1)。低劑量的DCA(50 μmol/L和100 μmol/L)對IL-6蛋白的影響與對照組之間的差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.103，P=0.053)，但是高劑量的DCA(≥200 μmol/L)明顯增加IL-6的表達(dá)(P<0.001)。高劑量的DCA與低劑量的DCA相比，其TNF-α、IL-6和IL-8蛋白表達(dá)明顯增強(P<0.001)。與DCA(200 μmol/L)干預(yù)組相比，NAC明顯抑制其誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-8蛋白的表達(dá)(P<0.001)。

表1DCA與NAC對EAC細(xì)胞炎癥因子蛋白水平的影響

與對照組相比，*P<0.001；與低劑量DCA(≤100 μmol/L)相比，#P<0.001；與200 μmol/L DCA相比，**P<0.001。

2.4DCA對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響與對照組相比，隨著DCA濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，呈劑量依賴性(P<0.001，圖3)，并且高劑量的DCA(≥200 μmol/L)對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響比低劑量DCA(≤100 μmol/L)的作用更明顯(P<0.001)。此外，ROS清除劑NAC明顯減少DCA誘導(dǎo)的ROS水平(P<0.001)。

圖3DCA(μmol/L)與NAC(mmol/L)對EAC細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

Fig.3 Effects of DCA (μmol/L) or/and NAC (mmol/L) on intra-cellular ROS level in OE19 cells

D1組：對照組；D2～ D5組：50、100、200、300 μmol/L DCA組；D6組：200 μmol/L DCA+5 mmol/L NAC。與對照組相比，*P<0.001；與低劑量DCA(≤100 μmol/L)相比，#P<0.001；與200 μmol/L DCA相比，**P<0.001。

3 討 論

炎癥與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，其中有25%的實體瘤是由炎癥引起的[9]，其被認(rèn)為是癌癥形成的第7大危險因素[10]。各種化學(xué)損傷及應(yīng)激事件通過觸發(fā)細(xì)胞浸潤及釋放炎癥細(xì)胞因子引發(fā)炎癥反應(yīng)及組織損傷。在炎癥部位，活化的炎癥細(xì)胞及免疫細(xì)胞能夠產(chǎn)生ROS，引起DNA損傷、癌基因活化及抑癌基因失活促使腫瘤的形成和進(jìn)展[8]。EAC是在胃食管反流物酸和膽酸作用下經(jīng)過反流性食管炎-Barrett食管-異型增生等一系列過程進(jìn)展而來，是胃食管反流長期作用形成的慢性炎癥的并發(fā)癥。膽酸反流至食管下段誘導(dǎo)食管癌變發(fā)生，也能夠活化多種信號通路促使腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移，其中尤以DCA的毒性作用最強。DCA通過誘發(fā)食管慢性炎癥及食管損傷發(fā)揮其細(xì)胞毒性及遺傳毒性作用，促使EAC形成和進(jìn)展[8]。DCA的毒性作用與其濃度密切相關(guān)，胃食管反流患者體內(nèi)DCA的濃度在0～280 μmol/L之間[11]，高濃度DCA(>100 μmol/L)能誘導(dǎo)EAC細(xì)胞DNA損傷，相反，低濃度DCA(<100 μmol/L)無DNA損傷作用[5]。

本研究表明，低劑量的DCA(50～150 μmol/L)作用于OE19細(xì)胞對細(xì)胞活性無明顯影響，高劑量的DCA(≥200 μmol/L)作用于OE19細(xì)胞后，隨著藥物濃度增加，作用時間延長，細(xì)胞活性明顯受到抑制，呈時間-效應(yīng)及劑量-效應(yīng)依賴方式，說明高劑量的DCA具有明顯的細(xì)胞毒性作用，亦是發(fā)揮生物學(xué)作用的有效濃度，這與SONG等[12]的研究結(jié)果相一致。因此，可以根據(jù)反流至食管下段的DCA的濃度將反流患者分為易患EAC的低危和高危人群，同時DCA的濃度也能作為一個分子標(biāo)志物，用于預(yù)測反流患者罹患EAC的風(fēng)險。

膽酸能誘導(dǎo)食管損傷及慢性炎癥發(fā)生。慢性炎癥主要通過改變細(xì)胞遺傳學(xué)以及表觀遺傳學(xué)影響細(xì)胞周期，如DNA損傷和DNA甲基化或組蛋白修飾，誘導(dǎo)食管癌變。此外，持續(xù)存在的慢性炎癥能夠釋放各種炎癥調(diào)節(jié)物質(zhì)，如ROS、活化的蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子(CDX2、NF-κB)、炎癥細(xì)胞因子及前列腺素等[13]，促使細(xì)胞生長和浸潤、細(xì)胞突變及血管形成，誘導(dǎo)腫瘤形成以及轉(zhuǎn)移，其中ROS在炎癥與食管癌變之間發(fā)揮著重要作用[8]。近來研究表明，EAC組織中促炎細(xì)胞因子NF-κB、COX-2、IL-1β、TNF-α、IL-8[14]和IL-6[15]明顯高表達(dá)，并且酸和膽酸通過活化NF-κB促使EAC細(xì)胞表達(dá)IL-8和IL-1β[16]。DCA誘導(dǎo)的慢性炎癥通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平促使EAC細(xì)胞DNA損傷以及NF-κB活化[5,7]，ROS清除劑NAC以及抗氧化物質(zhì)(維生素C)通過減少ROS釋放能夠抑制DCA誘導(dǎo)的DNA損傷[17]及NF-κB活化[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度DCA作用于OE19細(xì)胞后，與對照組相比，DCA明顯上調(diào)炎癥因子的表達(dá)及ROS水平，隨著藥物濃度增加，炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8和IL-6 mRNA和蛋白水平及細(xì)胞內(nèi)ROS水平均明顯增加，呈劑量依賴性。采用ROS清除劑NAC與DCA聯(lián)合作用后，能明顯降低DCA誘導(dǎo)的ROS水平以及炎癥因子表達(dá)。因此，DCA發(fā)揮促炎作用主要通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平實現(xiàn)。隨著細(xì)胞內(nèi)的ROS水平增加及機體的抗氧化能力下降，形成氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而促使食管炎癥形成，同時氧化應(yīng)激也能活化一些轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB)，促使基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)及癌癥的發(fā)生和發(fā)展[8,18]。

在EAC中，DCA具有明顯的細(xì)胞毒性及促炎作用，呈劑量依賴性，DCA的促炎作用可能與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平密切相關(guān)。進(jìn)一步研究產(chǎn)生ROS的來源以及尋找合適的抗氧化物質(zhì)作為潛在的化療藥物用于EAC及癌前病變等相關(guān)疾病的治療。

參考文獻(xiàn)：

[1] SCHMASSMANN A, OLDENDORF MG, GEBBERS JO. Changing incidence of gastric and oesophageal cancer subtypes in central Switzerland between 1982 and 2007[J]. Eur J Epidemiol, 2009, 24(10):603-609.

[2] BROWN LM, DEVESA SS, CHOW WH. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age[J]. J Natl Cancer Inst, 2008, 100(16):1184-1187.

[3] COUSSENS LM, WERB Z. Inflammation and cancer [J]. Nature, 2002, 420(6917):860-867.

[4] TRIADAFILOPOULOS G. Proton pump inhibitors for Barrett’s oesophagus[J]. Gut, 2000, 46(2):144-146.

[5] JENKINS GJ, CRONIN J, ALHAMDANI A, et al. The bile acid deoxycholic acid has a non-linear dose response for DNA damage and possibly NF-kappaB activation in oesophageal cells, with a mechanism of action involving ROS[J]. Mutagenesis, 2008, 23(5):399-405.

[6] CHEN KH, MUKAISHO K, SUGIHARA H, et al. High animal-fat intake changes the bile-acid composition of bile juice and enhances the development of Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma in a rat duodenal-contents reflux model[J]. Cancer Sci, 2007, 98(11):1683-1688.

[7] JENKINS GJ, D’SOUZA FR, SUZEN SH, et al. Deoxycholic acid at neutral and acid pH, is genotoxic to oesophageal cells through the induction of ROS: The potential role of anti-oxidants in Barrett's oesophagus[J]. Carcinogenesis, 2007, 28(1):136-142.

[8] ABDEL-LATIF MM, DUGGAN S, REYNOLDS JV, et al. Inflammation and esophageal carcinogenesis[J]. Curr Opin Pharmacol, 2009, 9(4):396-404.

[9] HUSSAIN SP, HARRIS CC. Inflammation and cancer: an ancient link with novel potentials[J]. Int J Cancer, 2007, 121(11):2373-2380.

[10] COLOTTA F, ALLAVENA P, SICA A, et al. Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer:links to genetic instability[J]. Carcinogenesis, 2009, 30(7):1073-1081.

[11] NEHRA D, HOWELL P, WILLIAMS CP, et al. Toxic bile acids in gastro-oesophageal reflux disease: influence of gastric acidity[J]. Gut, 1999, 44(5): 598-602.

[12] SONG S, GUHA S, LIU K, et al. COX-2 induction by unconjugated bile acids involves reactive oxygen species-mediated signalling pathways in Barrett’s oesophagus and oesophageal adenocarcinoma[J]. Gut, 2007, 56(11):1512-1521.

[13] POEHLMANNA A, KUESTERA D, MALFERTHEINER P, et al. Inflammation and Barrett’s carcinogenesis[J]. Pathol Res Pract, 2012, 208(5): 269-280.

[14] COLLEYPRIEST BJ, WARD SG, TOSH D. How does inflammation cause Barrett’s metaplasia? [J]. Curr Opin Pharmacol, 2009, 9(6):721-726.

[15] DVORAKOVA K, PAYNE CM, RAMSEY L, et al. Increased expression and secretion of interleukin-6 in patients with Barrett’s esophagus[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(6):2020-2028.

[16] JENKINS GJ, HARRIES K, DOAK SH, et al. The bile acid deoxycholic acid (DCA) at neutral pH activates NF-kappaB and induces IL-8 expression in oesophageal cellsinvitro[J]. Carcinogenesis, 2004, 25(3):317-323.

[17] FOUNTOULAKIS A, MARTIN IG, WHITE KL, et al. Plasma and esophageal mucosal levels of vitamin C: role in the pathogenesis and neoplastic progression of Barrett's esophagus [J].Dig Dis Sci, 2004, 49(6):914-919.

[18] GRETEN FR, ECKMANN L, GRETEN TF, et al. IKKbeta links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer[J]. Cell, 2004, 118(3):285-296.