王紅英，黃琳紅，馬耀茹，賀建宇

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物研究所，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬紅會(huì)醫(yī)院，陜西西安 710054；3. 西安洲良明康生物醫(yī)藥科技有限公司，陜西西安 710075)

中風(fēng)是中老年的常見病、多發(fā)病，是當(dāng)今世界對(duì)人類危害最大的3種疾病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高以及并發(fā)癥多的“四高一多”特點(diǎn)。近年來，由于診療水平的提高，中風(fēng)的死亡率有所降低，但致殘率仍居高不下，約80%的存活者尚有不同程度的功能障礙，即中風(fēng)后遺癥，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。有研究表明，血液流變學(xué)狀態(tài)的改變?cè)谛哪X血栓形成至最終發(fā)展為心腦梗死的過程中起到重要作用[2]。通腦溶栓膠囊由黃芪、粉葛、川芎、桃仁、雞血藤、地龍等中藥材組成的中藥新藥，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效，臨床主治中風(fēng)恢復(fù)期(腦梗死)所致的半身不遂、口眼歪斜、偏身感覺麻木、肢體痙攣、語言不利等屬氣虛血瘀證者。本研究通過制備大鼠體內(nèi)血栓模型，觀察通腦溶栓膠囊對(duì)體內(nèi)血栓形成和血液流變學(xué)的影響，探討其活血化瘀的作用機(jī)制，為該復(fù)方制劑的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器通腦溶栓膠囊(陜西博森生物制藥股份集團(tuán)有限公司，規(guī)格：0.4 g/粒，批號(hào)：081201)；血栓心脈寧膠囊(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.5 g/粒，批號(hào)：081102)；3 g/L戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：060222)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，成都科龍化工試劑廠，批號(hào)：20081120)；磷酸緩沖液、EDTA緩沖液、EDTA-甲醛緩沖液；100 g/L高分子右旋糖酐(DEXTRAN500，Amersham Biosciences，批號(hào)：301622)；5 g/L肝素生理鹽水溶液(天津市生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)：20120205)；EDTA(浙江拱東醫(yī)用塑料廠，批號(hào)：0603147)。多道生理機(jī)能儀(成都儀器廠，型號(hào)：6280C)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，AB204-N)；血細(xì)胞自動(dòng)分析儀(日本光電公司，MEK-6318K)；血凝儀(中山市培康醫(yī)療電子有限公司，PK-B)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16G)；血黏度分析儀(北京宏潤科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：YDA-IV)；100 g/L水合氯醛(分析純，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，體質(zhì)量200～300 g，雌雄各半，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)資格證號(hào)：SCXK(陜)2007-001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(陜)2007-003。動(dòng)物顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及給藥方法 將3批各50只SD大鼠隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組(血栓心脈寧膠囊)及通腦溶栓膠囊低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半。陰性對(duì)照組灌胃給予5 g/L的CMC-Na，其余各組給予對(duì)應(yīng)的受試品CMC-Na混懸液，按1 mL/100 g 給藥，1次/d，分別進(jìn)行動(dòng)、靜脈血栓模型及血小板聚集實(shí)驗(yàn)；另取60只大鼠隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、模型組、陽性組及通腦溶栓膠囊低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半，進(jìn)行血瘀大鼠血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2頸總動(dòng)脈血栓模型的制備[3]連續(xù)給藥25 d后，腹腔注射3 g/L戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，頸正中切口，分離、動(dòng)脈夾結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。缺血1 h后灌胃給藥，繼續(xù)缺血1 h后解除動(dòng)脈夾實(shí)施再灌注，血流再通，縫合切口，自由飲食飼養(yǎng)24 h。電流設(shè)定4 mA，刺激時(shí)間7 min，之后縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)，手術(shù)均為無菌操作。再連續(xù)灌胃給藥5 d，末次給藥1 h后，再次麻醉大鼠，頸正中切口，取出包含血栓的頸總動(dòng)脈，分離血栓，在濾紙上吸干血液與水分，稱量血栓重量。

1.3.3靜脈血栓模型的制備[4]連續(xù)給藥30 d后，腹腔注射100 g/L水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，腹中線切口，分離下腔靜脈，用粗線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈，縫合切口。4 h后，重新打開腹腔，在結(jié)扎下方2 cm處夾閉管腔，剖開該段管腔，并將管腔內(nèi)血液吸盡，取出血栓，放濾紙上，吸干血液，稱量血栓濕重。

1.3.4血小板聚集及凝血指標(biāo)的測(cè)定[5]連續(xù)給藥30 d，末次給藥30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)麻醉，用內(nèi)徑1 mm的玻璃毛細(xì)管插入鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，至毛細(xì)管血柱達(dá)5 cm。每隔30 s折斷毛細(xì)管一段，檢查有無出現(xiàn)凝血絲，計(jì)算毛細(xì)管采血到出現(xiàn)凝血絲的時(shí)間，即為凝血時(shí)間。然后仰臥位固定大鼠，開腹暴露腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，用分別裝有2 mL EDTA緩沖液和EDTA-甲醛緩沖液的5 mL注射器下腔靜脈采血0.5 mL，棄去注射器頭部的血液約0.1 mL，將余下的血液分別注入5 mL塑料離心管中，混勻，室溫放置15 min，以500 r/min離心10 min，取上層血漿，測(cè)定血小板計(jì)數(shù)(PLT)，計(jì)算血小板聚集率(PAgT)。

PAgT=[PLT(EDTA緩沖液)-PLT(EDTA-甲醛緩沖液)]/PLT(EDTA緩沖液)×100%。

另用32.1 g/L檸檬酸鈉和EDTA·K2真空采血管分別從腹主動(dòng)脈采血，立即測(cè)定凝血酶時(shí)間(TT)、血漿凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)。

1.3.5血液流變學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 連續(xù)給藥30 d，末次給藥后1 h，各組大鼠尾靜脈注射100 g/L高分子右旋糖酐(0.5 mL/100 g)，15 min后，腹主動(dòng)脈取血6～7 mL，1 mL全血EDTA抗凝測(cè)定紅細(xì)胞壓積(HCT)，0.8 mL全血肝素抗凝測(cè)定全血黏度，剩余血液3 000 r/min離心15 min，測(cè)血漿黏度。

2 結(jié) 果

2.1通腦溶栓膠囊對(duì)大鼠體內(nèi)血栓形成的影響與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組的頸動(dòng)脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明實(shí)驗(yàn)方法可靠。與陰性對(duì)照組比較，通腦溶栓中、高劑量組動(dòng)脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01，表1)。

與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組的下腔靜脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明實(shí)驗(yàn)方法可靠。與陰性對(duì)照組比較，通腦溶栓低、中、高劑量組靜脈血栓濕重明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01，表2)。

表1通腦溶栓膠囊對(duì)大鼠體內(nèi)動(dòng)脈血栓形成的影響

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2通腦溶栓膠囊對(duì)大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成的影響

Tab.2 Effects of Tong-nao thrombolysis capsule on venous thrombosis in rats

n=10)

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2通腦溶栓膠囊對(duì)大鼠血小板聚集及凝血功能的影響與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組血栓心脈寧膠囊可延長凝血時(shí)間及PT，降低PAgT，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；通腦溶栓膠囊低劑量組可延長APTT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；通腦溶栓膠囊中劑量組能延長血凝時(shí)間及PT，降低PAgT，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；通腦溶栓膠囊高劑量組，可延長PT及APTT，降低PAgT，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3)。

表3通腦溶栓膠囊對(duì)大鼠凝血時(shí)間、血小板功能及抗凝血作用的影響

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3通腦溶栓膠囊對(duì)血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響與陰性對(duì)照組比較，大鼠尾靜脈注射100 g/L高分子右旋糖酐后，模型對(duì)照組的各項(xiàng)血液流變學(xué)指標(biāo)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，說明血瘀模型制備成功。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和通腦溶栓高劑量組的全血高切變率、中切變率、低切變率及血漿黏度均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，通腦溶栓中劑量組的全血高切變率、中切變率及血漿黏度均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表4通腦溶栓膠囊對(duì)血瘀大鼠模型血液流變學(xué)的影響

與模型對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

3 討 論

腦梗死是缺血性腦血管疾病，血栓或栓塞性血管阻塞在缺血性腦血管疾病的發(fā)病中起著十分重要的作用[6]，目前缺乏理想的治療藥物。在中醫(yī)理論中，對(duì)缺血性腦梗死病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)有多種學(xué)說，如痰瘀互結(jié)、痰熱腑實(shí)、肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、腎氣虛弱等，但大多數(shù)學(xué)者仍傾向于氣虛血瘀是缺血性中風(fēng)的主要病因病機(jī)。也就是說，血液的高黏、高凝、高聚狀態(tài)，血液流變學(xué)指標(biāo)發(fā)生異常，血液黏度增高、纖維蛋白原顯著增加、紅細(xì)胞變形能力降低，是血栓形成導(dǎo)致腦梗死的重要因素[7]。

益氣活血法是治療中風(fēng)病的基本治法，益氣為治本之法，活血為治標(biāo)之法[8]。益氣使人體氣機(jī)充沛，功能正常，氣血調(diào)和，正氣強(qiáng)盛；活血化瘀可使經(jīng)絡(luò)通暢，氣血調(diào)暢，郁火不生，清竅、腦絡(luò)不受蒙蔽。本研究中的通腦溶栓膠囊是由黃芪、粉葛、川芎、桃仁、雞血藤、地龍等中藥材組成的中藥新藥，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。黃芪有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，黃芪使冠狀血管和腎臟血管擴(kuò)張，并使全身末梢血管擴(kuò)張，皮膚循環(huán)暢盛，使高血壓患者血壓下降[9]。而葛根的有效成分大豆黃酮等可明顯促進(jìn)腦、冠脈循環(huán)，改善腎上腺素所致微循環(huán)障礙，并對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用[10]。文獻(xiàn)報(bào)道[11],桃仁提取液能明顯增加腦血流量，降低血管阻力，改善血流動(dòng)力學(xué)狀況，桃仁可使小鼠的出血及凝血時(shí)間明顯延長，煎劑對(duì)體外血栓有抑制作用。雞血藤有散氣、活血、舒筋、活絡(luò)等功效。研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤生藥水煎醇沉劑可明顯抗血小板聚集[12]。

本研究結(jié)果表明，通腦溶栓膠囊對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性血栓形成有顯著的抑制作用，表明通腦溶栓膠囊能降低活體動(dòng)物動(dòng)脈血流中血小板黏附聚集功能；同時(shí)，通腦溶栓膠囊對(duì)大鼠凝血功能有一定影響，可降低血小板聚集率，明顯延長凝血時(shí)間、PT及APTT，對(duì)血液流變學(xué)指標(biāo)也有明顯的改善作用，能顯著降低高分子右旋糖酐所致大鼠血瘀模型的血液黏度，改善血液循環(huán)，從而有效地避免了血栓形成的潛在風(fēng)險(xiǎn)，充分體現(xiàn)了通腦溶栓膠囊所具有的活血化瘀、通絡(luò)的功能。但其確切的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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