譚 敬，朱宇麟，周榮勝，張曉琪，趙 鴿，劉齊寧

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710061)

肝大部切除術中常使用肝門阻斷法減少術中出血，常不可避免地造成肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)。IRI不但造成肝細胞死亡，也會使肝再生能力受損[1]。肝再生的調控是一個非常復雜的過程，不但有眾多細胞因子參與，而且DNA合成、細胞周期轉化、有絲分裂都是能量消耗過程因此維持穩(wěn)定的能量代謝是維持肝再生的重要方面。烏司他丁(Ulinastatin, UTI)，一種尿胰蛋白酶抑制劑，具有抑制多種酶(胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質酸酶、彈性蛋白酶等)的活性，在治療胰腺炎、抗腫瘤、抗休克和肝臟切除圍手術期等方面已經引起了廣泛的重視。以往研究證實UTI對肝IRI具有良好的保護作用[2]。我們也發(fā)現UTI對肝IRI后的肝再生有保護作用[3]。但是，UTI對肝再生影響的機制尚未完全清楚。本研究擬在建立大鼠70%肝大部切除合并IRI模型的基礎上，觀察UTI對肝再生過程中能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級雄性SD大鼠120只，3月齡，體質量230～280 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2試劑及儀器烏司他丁由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司提供(批號03091123)；AnnexinV/FITC細胞凋亡試劑盒購自珠海健康元生物醫(yī)藥有限公司；兔抗鼠細胞核增殖抗原(PCNA)抗體試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；ATP、ADP、AMP標準品購自美國Sigma公司；全自動生化分析儀購自日本Olympus公司；流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司；高壓液相色譜儀購自美國HP公司。

1.3方法

1.3.1動物分組和模型制備 120只大鼠隨機分為三組，分別為單純肝切除組(PH)、肝切除合并缺血再灌注組(PHIR) 和烏司他丁組(UTI)，每組40只。大鼠術前禁食8 h，不禁飲。100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，經陰莖背靜脈注入稀釋肝素(500 U/kg)，使其肝素化。仰臥位固定四肢，燈照保暖，常規(guī)剔毛消毒，取劍突下腹正中縱行切口約3 cm，依次切開腹壁各層進入腹腔，顯露肝十二指腸韌帶，以3-0絲線結扎肝左、中葉根部，行左、中葉肝臟切除術，約占70%肝總體積。保留肝(肝右、尾葉)作不同處理：PH組不阻斷保留肝葉血流；PHIR組在切除肝左、中葉的同時用小號無損傷動脈夾阻斷肝右、尾葉的血流30 min，后恢復其血流；UTI組與PHIR組肝臟切除及保留肝斷流處理相同，但于缺血前5 min經尾靜脈給予UTI 50 000 U/kg。術后皮下注射含青霉素的生理鹽水2 mL(80 000 U/mL)預防感染。各組分別于再灌注后1、6、12、24和48 h采集下腔靜脈血4 mL和肝右葉相同部位肝組織約3 g進行各項指標檢測，每時點8只大鼠。

1.3.2檢測指標 ①丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase, ALT)和谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)：將各時點采集的大鼠下腔靜脈血，以半徑20 cm、4 000 r/min(35 000 g)離心10 min，分離上層血清，全自動生化分析儀檢測ALT和AST活性。②肝細胞凋亡指數(apoptosis index, AI)：取儲存肝組織1.0 g，解凍后制備肝細胞懸液，經消化、計數，取(3～5)×105個細胞置于流式管中，PBS液洗滌離心2次。加入稀釋的結合緩沖液100 μL，吹打混勻后加入5 μL的AnnexinV/FITC和10 μL的碘化丙啶(PI)，室溫下避光反應15 min。再加入400 μL PBS吹打混勻后上流式細胞儀檢測細胞的凋亡指數。③殘肝再生度：按SHERGILL等[4]提供的方法略加修改計算肝再生度。大鼠肝臟左、中葉切除后立即稱重(B)，用以計算大鼠初始肝重(A=B/0.7)，即切除肝重為初始肝重的70%。預定時點處死大鼠后，切下全部保留肝組織并稱重(C)。肝再生度計算公式為：肝再生度=[(C-0.3×A)/A]×100%。④殘肝組織PCNA：采用免疫組化法測定再灌注后24和48 h兩時點肝組織PCNA，按PCNA免疫組化試劑盒提供的方法制備肝細胞切片和PCNA染色，以胞核呈現界限清楚的棕黃色為陽性細胞。每只大鼠取5張切片，光鏡下每張切片隨機挑選10個200倍視野，計數每個視野中100個肝細胞中含有的陽性細胞數，計算各組平均PCNA陽性百分率。⑤肝組織ATP、ADP和AMP的含量和能量負荷：采用高壓液相色譜法測定ATP、ADP和AMP的含量，將ATP、ADP和AMP標準品稀釋成外標母液備用。取術后24、48 h大鼠肝組織1 g，液氮研磨后加20倍體積0.4 moL/L的HClO4制取勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，取上清。再用2.5 moL/L的K2CO3調pH至中性，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，取上清檢測ATP、ADP和AMP的濃度。色譜條件為ODS柱(250×4.6 id 5 μm)，流動相為0.05 moL/L磷酸鹽緩沖液與甲醇，室溫條件下流速1.0 mL/min，UV 254 nm，ATT-3，吸收率0.02，紙速0.5 cm/min，進樣量10 μL。組織能量負荷公式為([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])[5]。

1.3.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數據以均數±標準差表示，組間先進行方差齊性檢驗，若組間方差齊，則組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，并行藥物處理和時間交互作用檢驗；若組間方差不齊，則采用非參數檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1UTI抑制了IRI后血清ALT、AST活性升高PH組ALT、AST活性于再灌注早期逐漸升高，12 h達高峰，隨后逐漸下降。與PH組比較，PHIR組各時點ALT、AST活性升高更加明顯(P<0.05)。UTI組各時點ALT、AST活性較PHIR組有所降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。不同處理與時間交互作用的差異無統(tǒng)計學意義。

表1各組不同時點血清ALT、AST活性的比較

Tab.1 Serum ALT and AST activities in each group at different time points after reperfusion

n=8)

與PH組比較，*P<0.05；與PHIR組比較，#P<0.05。

2.2UTI減輕了IRI引起的肝細胞凋亡PHIR和UTI組再灌注后AI逐漸升高，12 h達峰值，隨后下降。與PH組相比，PHIR組AI于6 h到48 h明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與PHIR組相比，UTI組AI于再灌注6 h到24 h明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。不同處理與時間交互作用的差異無統(tǒng)計學意義。

2.3UTI減輕了IRI對肝再生的抑制與PH組比較，PHIR組術后24、48 h肝再生度降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，UTI組肝再生度雖然下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與PHIR組比較，UTI組術后24、48 h肝再生度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。與PH組比較，PHIR組術后24、48 h PCNA表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，UTI組PCNA雖然下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與PHIR組比較，UTI組術后24、48 h PCNA表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3、圖1)。

表2各組不同時點殘肝組織細胞凋亡指數(%)的比較

Tab.2 Apoptosis index of the regenerated liverin each group at different time points

n=8)

與PH組比較，*P<0.05；與PHIR組比較，#P<0.05。

表3各組24、48h肝再生度和PCNA陽性率的比較

Tab.3 Regenerated liver weight and PCNA positivity rate in each group at 24h and 48h after reperfusion

n=8)

與PH組比較，*P<0.05 ；與PHIR組比較，#P<0.05。

2.4UTI改善了IRI后的肝組織代謝與PH組相比，PHIR和UTI組再灌注24、48 h的ATP含量都明顯下降(P<0.05)，但UTI組ATP含量較PHIR組明顯升高(P<0.05)。PHIR組和UTI組48 h ADP和AMP含量都明顯高于PH組(P<0.05)。UTI組的能量負荷優(yōu)于PHIR組(P<0.05，表4)。

圖1三組術后24、48h肝組織PCNA的表達情況

Fig.1 The expression of PCNA in hepatic issues in the three groups at 24 h and 48 h after operation (PCNA, ×200)

A1、A2：PH組；B1、B2：PHIR組；C1、C2：UTI組。

表4各組24、48h肝組織ATP、ADP和AMP含量和能量負荷的比較

Tab.4 ATP, ADP and AMP contents and energy charge in hepatic tissues of each group at 24 h and 48 h after reperfusion

n=8)

與PH組比較，*P<0.05；與PHIR組比較，#P<0.05。

3 討 論

肝臟具有強大的再生功能，但當伴有肝組織部分缺失時，IRI可引發(fā)肝再生能力下降,誘發(fā)術后肝功能衰竭[1,5]。本研究結果顯示PHIR組血清ALT和AST，肝細胞凋亡指數都明顯高于PH組，表明本研究中PHIR組出現明顯的肝功能損害，說明模型制備是成功的；而PHIR組殘肝組織的PCNA表達和肝再生度較PH組明顯降低，說明IRI確實抑制了肝大部切除術后殘肝再生功能，這與以往的研究結果相同[6]。

UTI是由143個氨基酸組成的酸性糖蛋白，含有由5個氨基酸連接的Kunitz型結構域，能抑制α-糜蛋白酶、胰蛋白酶等多種蛋白酶。研究表明UTI能通過抑制中性粒細胞的活化和脫顆粒而減輕IRI[7]。本研究結果顯示UTI預處理后，UTI組的血清ALT和AST，肝細胞凋亡指數都明顯低于PHIR組，而再灌注后24h和48h的PCNA陽性表達率和肝再生度明顯高于PHIR組，表明UTI不但能減輕肝大部切除術合并缺血再灌注的肝IRI，也能明顯緩解IRI對肝再生的抑制作用。

肝再生過程受眾多細胞因子的調控，我們發(fā)現UTI可能通過TNF-α/IL-6/STAT- 3信號通路調節(jié)肝再生[3]。而肝再生也是一個耗能過程，DNA合成、細胞周期轉換和有絲分裂等過程都需要大量能量。ATP是細胞內主要的能量物質，細胞進行DNA復制和細胞分裂增殖必須依賴足夠數量的ATP。觀察表明肝切除后肝組織釋放ATP調節(jié)肝臟再生[8]。肝硬化的患者,部分肝切除后，肝細胞存在能量代謝失衡，ATP 水平顯著降低，導致肝再生狀態(tài)顯著地受到抑制,易誘發(fā)肝功能衰竭。線粒體是細胞內生成ATP的主要場所，IRI會造成線粒體損傷，使線粒體產生ATP的能力發(fā)生障礙[9]。我們也發(fā)現IRI會促進肝線粒體膜通透性轉換孔開放，破壞正常的線粒體膜電位，而正常的線粒體膜電位是合成ATP的基礎[10]。UTI通過其膜穩(wěn)定作用，對肝IRI時的線粒體損傷具有保護作用[11]。TAIE等[12]發(fā)現UTI對腎IRI的保護作用與促進細胞內ATP和Na濃度恢復，維護細胞內酸堿水平，保護線粒體結構有關。本研究證實UTI預處理后，再灌注24 h和48 h的肝組織ATP含量和能量負荷水平明顯高于PHIR組，表明UTI對肝再生的促進作用與維持能量代謝，增高肝細胞內ATP水平有關，其原因可能與UTI減輕了再灌注后線粒體損傷有關。

綜上所述，本研究提示UTI對肝大部切除合并IRI具有保護作用，UTI預處理能促進殘肝再生，其機制與促進肝組織的能量代謝，增加ATP水平有關。

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