趙艷秋，劉 杰，劉瑞青，張建波，孫曉楠，王 喻，李醒亞

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，河南鄭州 450008； 2.河南省人民醫(yī)院介入科，河南鄭州 450000；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州 450003)

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見病因[1]，其中腺癌作為肺癌中最常見的組織學(xué)亞型，無論在男性還是在女性近年來發(fā)生率都逐漸增加[2]。肺腺癌組織異質(zhì)性很大，亞型分類復(fù)雜多樣，目前其主要的亞型分類標(biāo)準(zhǔn)包括2004年的WHO分類[3]和2011年國際肺癌研究學(xué)會、美國胸科學(xué)會和歐洲呼吸學(xué)會(IASLC/ATS/ERS)聯(lián)合推出的肺腺癌國際多學(xué)科分類新標(biāo)準(zhǔn)[4]。

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變和肺腺癌的某些特殊亞型相關(guān)，如伏壁樣為主型腺癌(原來的非黏液性BAC)具有更高的EGFR突變率[5-6]，對EGFR酪氨酸激酶抑制劑也更為敏感[7-8]。另外一些相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，EGFR突變與含乳頭狀和微乳頭狀亞型成分的腺癌呈正相關(guān)[5,9-11]；與此相反，黏液性BAC的EGFR突變率卻非常低[12-13]。中國肺腺癌人群具體組織學(xué)亞型與EGFR突變狀態(tài)之間的關(guān)系并不十分清楚，需要進一步的系統(tǒng)研究。在本實驗中，我們研究的內(nèi)容主要包括：①結(jié)合肺腺癌2004年WHO分類和2011年IASLC/ATS/ERS分類，分析肺腺癌組織學(xué)亞型與EGFR突變狀態(tài)之間的關(guān)系；②EGFR突變狀態(tài)與臨床病理特征之間的關(guān)系分析。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009～2011年確診的肺腺癌患者標(biāo)本206例，入組患者均有EGFR突變檢測結(jié)果。206例患者中女性99例(48.1%)，男性107例(51.9%)，年齡31～81歲，平均年齡58.6歲；非吸煙患者129例(62.6%)，吸煙患者77例(37.4%)；臨床分期采用2009年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)公布的修訂后的第7版國際肺癌分期法，其中Ⅰ期59例、Ⅱ期35例、Ⅲ期45例、Ⅳ期67例。EGFR突變患者91例(44.2%)，其中19外顯子缺失突變39例(18.9%)，21外顯子突變52例(25.2%)；穿刺活檢標(biāo)本62例(30.1%)，手術(shù)標(biāo)本144例(69.9%)。入組患者的臨床病理特征如表1所示。

1.2方法

1.2.1亞型鑒定 206例患者原始HE切片從醫(yī)院標(biāo)本庫中重新調(diào)閱，經(jīng)2位高年資的病理醫(yī)師盲法審閱，重新病理確診及亞型鑒定，意見不一致的樣本重新商討并達成一致觀點。分型標(biāo)準(zhǔn)參考2004年WHO分類系統(tǒng)和2011年IASLC/ATS/ERS分類方法，按照以下兩種方式進行評估：①參考2004年WHO分類系統(tǒng)(亞型成分的比例大于10%時認為含有此種亞型成分)，按照是否含有某種組織學(xué)亞型成分進行分類(如含腺泡成分組和不含腺泡成分組)；②依據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)中全面的組織學(xué)分型原則，以5%的增量半定量法評估組織學(xué)類型，并選擇一種作為主要類型，可分為伏壁樣生長為主型(以前的非黏液性BAC，LPD)、腺泡樣為主型(ACI)、乳頭狀為主型(PAP)、微小乳頭狀為主型(MIP)、實體型為主型(SOL)、浸潤性黏液腺癌(以前的黏液性BAC，IMA)6型。本研究入組患者中共有144例手術(shù)樣本，腺癌為139例，其中122例混合性腺癌可參照分型標(biāo)準(zhǔn)重新評估亞型，11例單一亞型腺癌，6例由于分化程度低、組織標(biāo)本過少等原因不能重新評估亞型，另有5例為其他類型非小細胞肺癌(包括4例腺鱗癌，1例鱗癌)。

1.2.2EGFR突變的檢測 采用擴增阻滯突變系統(tǒng) (amplification refractory mutation system，ARMS)法檢測EGFR熱點突變基因(19和21外顯子)的突變情況，熒光定量PCR的儀器號為：Stratagene Mx30009(德國)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計分析方法采用卡方檢驗以及Fisher精確概率法，當(dāng)P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床病理特征與EGFR突變的關(guān)系206例入組患者中，EGFR突變率為44.2%(91/206)，其中女性比男性具有更高的突變率(56.6%vs. 32.7%，P=0.001)；不吸煙患者比吸煙患者具有更高的突變率(51.9%vs. 31.2%，P=0.004)；綜合分析后發(fā)現(xiàn)，女性、不吸煙、腺癌患者的EGFR突變率達57.6%(53/92)。EGFR突變狀態(tài)與年齡、樣本類型(手術(shù)樣本和活檢樣本)及疾病分期無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1EGFR突變與臨床病理特征之間的關(guān)系

Tab.1 Relationship between EGFR mutation and clinicopathologic characteristics

臨床病理特征例數(shù)[n(%)]EGFR突變型[n(%)]EGFR野生型[n(%)]χ2P性別 男 女107(51.9)99(48.1)35(32.7)56(56.6)72(67.3)43(43.4)11.8660.001年齡(歲) ≥65 <6563(30.6)143(69.4)29(46.0)62(43.4)34(54.0)81(56.6)0.1270.722吸煙史 有 無77(37.4)129(62.6)24(31.2)67(51.9)53(68.8)62(48.1)8.4340.004分期 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ～Ⅳ期94(45.6)112(54.4)43(45.7)44(39.3)51(54.3)68(60.7)0.8740.350穿刺活檢62(30.1)26(41.9)36(58.1) 腺癌59(95.2)25(42.4)34(57.6) 非腺癌 3(4.8)1(33.3) 2(66.7)手術(shù)標(biāo)本144(69.9)66(45.8)78(54.2)0.2660.606a 腺癌139(96.5)65(46.8)74(53.2) 亞型可評估122(87.8)59(48.4)63(51.6) 非腺癌 5(3.5)1(20.0) 4(80.0)合計20691(44.2)115(55.8)

a：比較穿刺活檢標(biāo)本與手術(shù)標(biāo)本的EGFR突變狀態(tài)。

2.2組織學(xué)亞型特征及其與EGFR突變狀態(tài)的關(guān)系參考2004年WHO分類，122例混合性腺癌中最常見的組織學(xué)亞型成分是腺泡型(ACI，76.2%)，其次是非黏液性BAC(42.6%)、乳頭型(PAP，15.6%)、實體型(SOL，5.7%)和黏液性BAC(12.3%)。含有BAC成分的腺癌比不含此類成分的腺癌突變率更高(61.5%vs. 38.6%,P=0.012)，含有PAP成分的腺癌傾向比不含此成分的腺癌突變率高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.057)；相反，EGFR突變在含黏液性BAC成分的腺癌中比不含此類成分的腺癌突變率低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(13.3%vs. 53.3%,P=0.004，表2)。

依照2011年IASLC/ATS/ERS分類，最常見的亞型成分是腺泡樣為主型(45.1%，55/122)，其次是伏壁樣生長為主型(20.5%，25/122)、乳頭狀為主型(9.8%，12/122)、浸潤性黏液腺癌(9.0%，11/122)、微小乳頭狀為主型(4.1%，5/122)和實體型為主型(3.3%, 4/122)。乳頭狀為主型具有較高的EGFR突變率(66.7%)，而浸潤性黏液腺癌(27.3%)和實體型為主型(25%)突變率較低。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乳頭狀為主型腺癌EGFR突變率比實體型為主型和浸潤性黏液腺癌更高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.057，表3)。

表2腺癌標(biāo)本中含或不含某種亞型成分與EGFR突變的關(guān)系

Tab.2 Relationship between EGFR mutation and histologic subtypes with and without certain components in the resected specimens

分類合計[n(%)]EGFR突變型[n(%)]EGFR野生型[n(%)]χ2PBAC 有 無52(42.6)70(57.4)32(61.5)27(38.6)20(38.5)43(61.4)6.3020.012PAP 有 無19(15.6)103(84.4)13(68.4)46(44.7)6(31.6)57(55.3)3.6260.057ACI 有 無93(76.2)29(23.8)48(51.6)11(37.9)45(48.4)18(62.1)1.6570.198黏液BAC 有 無15(12.3)107(87.7)2(13.3)57(53.3)13(86.7)50(46.7)8.4020.004SOL 有 無 7(5.7)115(94.3)1(14.3)58(50.4)6(85.7)57(49.6)2.1570.142

表3依據(jù)2011年IASLC/ATS/ERS新分類法組織亞型與EGFR突變的關(guān)系

Tab.3 Relationship between EGFR mutation and histologic subtypes according to new IASLC/ATS/ERS classification method

組織亞型例數(shù)[122(100%)]EGFR突變型[59(48.4%)]EGFR野生型[63(51.6%)]P腺泡樣為主型55(45.1)23(41.8)32(58.2)伏壁樣生長為主型25(20.5)12(48.0)13(52.0)乳頭狀為主型12(9.8)8(66.7)4(33.3)微小乳頭狀為主型5(4.1)2(40.0)3(60.0)浸潤型黏液腺癌11(9.0)3(27.3)8(72.7)實體性為主型4(3.3)1(25)3(75.0)0.057a

A：分析方法為Fisher確切概率法(乳頭狀為主型 versus浸潤型黏液腺癌+實體性為主型)。

3 討 論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，亞裔、不吸煙、女性、肺腺癌患者是EGFR-TKI治療的優(yōu)勢人群[14]。在本研究中，入組患者均為腺癌，總的EGFR突變率為44.2%(91/206)，其在女性(P=0.001)、不吸煙(P=0.004)患者中突變率更高，同時符合女性、不吸煙、腺癌3個特征的患者EGFR突變率達57.6%(53/92)，與既往文獻報道一致。

2004年的WHO分類承認，80%～90%的肺腺癌均為混合性腺癌，單純型腺癌很少見[3]。在最近的幾年里，肺癌研究的主要進展大多集中在肺腺癌這一亞型上，人們逐漸發(fā)現(xiàn)基于病理學(xué)的肺腺癌分類方法已無法適應(yīng)多學(xué)科參與的個體化治療模式。在此背景下，2011年IASLC/ATS/ERS聯(lián)合推出了肺腺癌的國際多學(xué)科分類新標(biāo)準(zhǔn)[4]。在肺腺癌亞型的研究中，國外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其與EGFR突變狀態(tài)密切相關(guān)，并認為EGFR突變在非黏液性BAC、乳頭狀和微乳頭狀腺癌亞型中發(fā)生率更高，而在其他組織學(xué)亞型中發(fā)生率較低，尤其在黏液性BAC亞型中EGFR突變率更低[5-13]。在本研究中，我們結(jié)合2004年WHO分類系統(tǒng)和2011年IASLC/ATS/ERS新分類標(biāo)準(zhǔn)，探討了國內(nèi)肺腺癌人群中組織形態(tài)學(xué)特征能否反映EGFR的突變狀態(tài)。我們的研究結(jié)果進一步證實，含非黏液性BAC成分的腺癌EGFR突變率更高，而含黏液性BAC成分的腺癌EGFR突變率更低；以乳頭狀為主型腺癌的EGFR突變率高于浸潤型黏液腺癌和實體性為主型腺癌。

國外研究發(fā)現(xiàn)，與非黏液BAC相比，含乳頭狀成分的混合型腺癌突變率也很高[9,13]，乳頭型常被認為是BAC的進展形式[15]，兩者之間的生物學(xué)聯(lián)系和區(qū)別還需進一步的研究。在本研究中雖然含乳頭狀成分的腺癌突變率較高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.057)，可能是入組樣本數(shù)量過少的原因。

關(guān)于組織學(xué)亞型與EGFR突變之間存在密切聯(lián)系的真正原因，目前仍不是很清楚。相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，外周型肺腺癌主要起源于終末細支氣管的Clara(克拉拉)細胞和肺癌Ⅱ型上皮細胞，在該型腺癌中，甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)的表達常為陽性，位于中央氣道的腺癌主要起源于支氣管基底細胞和黏液分泌細胞，TTF-1的表達為陰性。層序聚類分析也提示，兩個差異的基因簇分別對應(yīng)終末呼吸單位(TRU)和非終末呼吸單位(N-TRU)來源的腺癌。日本學(xué)者YATABE等[6,16]發(fā)現(xiàn)，TRU來源的腺癌是一種特別的腺癌類型，與細支氣管肺泡癌(BAC)特征非常符合，表現(xiàn)出獨特的細胞學(xué)形態(tài)以及TTF-1和細胞表面蛋白表達。在149例TRU腺癌中，EGFR突變率為61.1%，97例EGFR突變患者中，高達91例(93.8%)為TRU腺癌。TRU腺癌預(yù)測EGFR突變具有高的敏感性和特異性，對EGFR-TKI治療更為有效。

日本學(xué)者YOSHIDA等[17]為了研究組織學(xué)亞型與EGFR突變間的關(guān)系，檢測了54例肺不典型腺瘤樣增生(肺腺癌的前期病變)的EGFR突變情況，并未發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者和未突變患者之間存在明顯的組織學(xué)差異，并且由于不典型腺瘤樣增生患者的EGFR突變頻率遠遠低于非黏液性BAC腺癌，作者猜測發(fā)生EGFR突變的不典型腺瘤樣增生在后來的疾病進展中很可能發(fā)展為非黏液性BAC腺癌。SAKUMA 等[18]為了研究EGFR突變和含BAC成分腺癌之間的關(guān)系，把114例非小細胞肺癌分為含黏液成分BAC、不含黏液成分BAC和不含BAC成分的腺癌，利用高靈敏度PCR方法檢測EGFR和KRAS突變狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，非黏液性BAC和黏液性BAC成分同EGFR和KRAS突變狀態(tài)之間存在著密切的聯(lián)系，由于88%含非黏液性BAC成分的腺癌都檢測到了EGFR突變。作者推斷EGFR突變可能是含非黏液性BAC成分的原位肺腺癌發(fā)病機制中的關(guān)鍵性事件。

在人類肺癌組織中，TTF-1主要在終末細支氣管的Clara(克拉拉)細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞中陽性表達，是肺腺癌的譜系特異性致癌基因，而鱗癌和大細胞癌很少表達[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，TTF-1主要表達在非黏液性肺腺癌中[21]。那么，與肺腺癌組織學(xué)特征密切聯(lián)系的TTF-1表達水平與EGFR突變之間是否存在聯(lián)系，我們將在隨后的研究中進一步探討。

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