錢倩倩，王邦寧，胡澤平，宋兵，馬東宇

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022）

肝細(xì)胞生長因子聯(lián)合纈沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

錢倩倩，王邦寧，胡澤平，宋兵，馬東宇

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022）

目的觀察肝細(xì)胞生長因子（HGF）聯(lián)合纈沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心肌凋亡的影響。方法24只14周齡雄性SHR隨機(jī)分為4組（n=24）：陽性對照組（P組，常規(guī)飼養(yǎng)，無藥物干預(yù)）、HGF組（H組，開胸，左心室壁五點(diǎn)直接注射5×109Pfu／m L Ad5-HGF，0.1 mL，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)4周），纈沙坦組（V組，纈沙坦灌胃30 mg·kg-1·d-1，4周），HGF聯(lián)合纈沙坦組（HV組，開胸，左心室壁五點(diǎn)直接注射5×109Pfu／mL Ad5-HGF，0.1 mL，術(shù)后纈沙坦灌胃30 mg·kg-1·d-1，4周），雄性Wistar大鼠（WKY）為健康對照（N組，n= 6）。治療前及治療后每周測量一次尾動脈壓。4周后處死大鼠，TUNEL法測心肌凋亡指數(shù)，ELASA法測心肌HGF、caspase-3濃度，免疫組織化學(xué)法及圖像分析系統(tǒng)分析心肌Bcl-xl水平。結(jié)果治療4周后，HV組、V組血壓較P組、H組明顯下降（P＜0.05）；與P組相比，H組、V組、HV組心肌凋亡指數(shù)及心肌caspase-3濃度明顯降低（P＜0.05），心肌HGF、抗心肌凋亡蛋白Bcl-xl水平明顯升高（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組尤為顯著。結(jié)論HGF、纈沙坦均可有效抑制SHR左心室心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重構(gòu)，且聯(lián)合使用效果優(yōu)于HGF、纈沙坦的單獨(dú)應(yīng)用。

細(xì)胞凋亡；大鼠，近交SHR；肝細(xì)胞生長因子；抗高血壓藥；肌細(xì)胞，心臟

高血壓左心室重構(gòu)是發(fā)生各種心血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與急性心肌梗死、急慢性心力衰竭、惡性心律失常、心臟性猝死等密切相關(guān)。目前研究證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡是左室重構(gòu)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［1］，其發(fā)生機(jī)制與高血壓發(fā)展過程中腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活有關(guān)，阻斷RAS系統(tǒng)中發(fā)揮主要活性作用的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）可以明顯減少心肌細(xì)胞凋亡，延緩心室重構(gòu)［2］。盡管血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）、AT1受體拮抗劑（ARB）等均可在不同程度上減輕AngⅡ介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，延緩和（或）逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)，但療效有限，目前仍缺乏特異性的治療藥物。近年來研究表明肝細(xì)胞生長因子（HGF）與受體C-met結(jié)合后有很強(qiáng)的抑制細(xì)胞凋亡，抗間質(zhì)纖維化，促血管形成作用，可在一定程度上改善并逆轉(zhuǎn)高血壓所致的心室重構(gòu)，是心血管疾病發(fā)展過程的保護(hù)因子［3-4］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)HGF的抗心肌纖維化，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)作用［5］。本研究的目的是選擇HGF與AT1受體拮抗劑纈沙坦聯(lián)合應(yīng)用，觀察對SHR心肌細(xì)胞凋亡的影響是否優(yōu)于HGF或纈沙坦單獨(dú)使用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 Wistar大鼠（WKY）6只，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）24只，14周齡，雄性，體質(zhì)量（250±10）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京2006-0009）。所有大鼠均在相同的條件下分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只，動物房保持空氣流通，恒溫（22±2）℃，恒濕（55%±5%），24h自由取食和飲水，飼料由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。其中WKY大鼠（n=6）為健康對照組（N組），SHR大鼠（n=24）隨機(jī)分為4組（n=6）：陽性對照組（P組）、HGF組（H組）、纈沙坦組（V組）、HGF聯(lián)合纈沙坦組（HV組）。

1.1.2 藥物及試劑 攜有肝細(xì)胞生長因子的腺病毒（Ad5-HGF，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所），纈沙坦（北京諾華制藥有限公司提供）。TUNEL凋亡試劑盒（Roche公司），ELASA試劑盒（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；免疫組織化學(xué)分析試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）。醫(yī)用青霉素（哈藥集團(tuán)制藥總廠）。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染Ad-HGF H組和HV組：根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)手術(shù)經(jīng)驗(yàn)，大鼠稱重后，用10%水和氯醛（0.3 mL／100 g）腹腔注射麻醉，經(jīng)口腔氣管插管，連接動物呼吸機(jī)（HX-300，成都泰盟科技有限公司），呼吸頻率設(shè)置為70～75次／min，潮氣量6～8mL，呼吸比為1∶2。以大鼠左胸第三肋間為中心，通過2.5～3 cm開口暴露心臟。將0.1mL 5x109Pfu／mL Ad5-HGF通過直接注射的方式轉(zhuǎn)染到左室游離壁的5個(gè)點(diǎn)，確切止血后，逐層縫合。術(shù)后肌注青霉素40萬單位／次×3 d，常規(guī)飼養(yǎng)4周。

1.2.2 纈沙坦灌胃V組和HV組（術(shù)后） 每日清晨，予以纈沙坦（30mg·kg-1·d-1）加等量蒸餾水灌胃1次，常規(guī)飼養(yǎng)4周。

圖1 治療4周后各組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色(×400)

圖2 治療4周后各組大鼠Bclxl免疫組織化學(xué)染色(×400)

插圖3-2

1.2.3 心臟標(biāo)本采集 飼養(yǎng)4周后處死大鼠，取出心臟，0.9%氯化鈉注射溶液洗凈，分離出左心室游離壁（包括室間隔），在左心室1／2處平行房室環(huán)水平橫切，用-80℃冰箱保存，用于ELISA檢測；一部分用10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋，制成5μm切片，每個(gè)心肌組織制備5張切片，用于TUNEL、免疫組織化學(xué)檢測。

1.2.4 TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 凋亡試劑盒由Roche公司提供，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。常規(guī)脫蠟水化，以下過程在濕盒中進(jìn)行：PBS 5 min ×2；蛋白酶K通透15min；PBS5min×3；TUNEL反應(yīng)混合液（TdT：生物素標(biāo)記的dUTP=1：9）37°C孵育60 min；PBS 5 min×2；轉(zhuǎn)化-POD 37°C30 min；PBS 5 min×3；DAB避光顯色10 min，蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、封片。在高倍鏡（Olympus，×400）下檢測，于凋亡陽性區(qū)域隨機(jī)選擇10個(gè)視野，用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件評定陽性細(xì)胞百分比（指陽性細(xì)胞占視野中所有細(xì)胞數(shù)的百分比），計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）。光鏡下，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核散大呈棕色，單個(gè)散在分布。

1.2.5 ELASA法檢測心肌HGF、caspase-3 實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。取60～80 mg左室心肌組織，制成20%勻漿后離心，取上清液100μL，采用雙抗體夾心法ELASA測定大鼠心肌的HGF、caspase-3水平。經(jīng)過包被，加樣，加酶標(biāo)抗體，加底物液顯色，終止反應(yīng)后，在ELASA檢測儀上，于450 nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.2.6 免疫組織化學(xué)分析Bcl-xl水平 常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，過氧化物酶滅活，山羊血清封閉，滴加一抗Bcl-xl（1：200），正常對照用PBS代替一抗，4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗（1：100）37℃孵育20 min，用DAB法顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明、封片。以胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃棕色顆粒表示為陽性表達(dá)。隨機(jī)選擇4個(gè)400倍顯微鏡視野圖像，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測Bcl-xl陽性細(xì)胞的平均吸光度值（MA）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。

表1 治療前后各組大鼠血壓比較（±s）

表1 治療前后各組大鼠血壓比較（±s）

注：與N組比較，aP＜0.05；與H組比較，bP＜0.05；與P組比較，cP＜0.05

?

表2 治療4周后各組大鼠AI、Bcl-xl、HGF、caspase-3比較（±s）

注：與P組相比，aP＜0.05，與HV相比，bP＜0.05

?

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓對比 治療前：N組SBP、DBP明顯低于P組、H組、V組、HV組（P＜0.05），后4組間血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療4周N組SBP、DBP顯著低于P組、H組、V組和HV組（P＜0.05）；V組、HV組大鼠與P組和H組大鼠相比，SBP、DBP明顯下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而P組與H組、V組與HV組血壓變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)對比 治療4周后N組大鼠與其他4組相比未見心肌細(xì)胞凋亡（P＜0.05）；H組、V組、HV組與P組相比，凋亡指數(shù)降低且HV組降低明顯（P＜0.05）；V組與H組凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2，圖1。

2.3 各組大鼠左心室心肌組織HGF、caspase-3比較 治療4周后與P組比較，HV組的HGF含量顯著增多（P＜0.05），其次為H組和V組；N組大鼠與其他4組相比僅有少量caspase-3表達(dá)（P＜0.05）；與P組相比，H組、V組、HV組caspase-3濃度明顯下降，其中HV組下降更顯著（P＜0.05）；V組與H組caspase-3濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.4 免疫組織化學(xué)分析心肌Bcl-xl 治療4周后N組大鼠有Bcl-xl表達(dá)；與P組相比，H組、V組、HV組Bcl-xl的MA明顯上升，其中HV組上升更明顯（P＜0.05），V組與H組Bcl-xl的MA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2，圖2。

3 討論

高血壓使心肌容量與壓力負(fù)荷增加，并長期處于過度牽拉狀態(tài)，室壁張力增高，氧化代謝持續(xù)上調(diào)，激活RAS系統(tǒng)參與高血壓發(fā)病并維持，AngⅡ與AT1受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高、凋亡蛋白（如Bcl-xl，P53）表達(dá)發(fā)生改變、caspase-3活化及細(xì)胞核間DNA斷裂等，引起線粒體膜電位改變通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，觸發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，致使心肌肥厚及心腔擴(kuò)大，發(fā)生心室重構(gòu)。

本研究結(jié)果表明，與健康對照組相比較，陽性對照組血壓明顯升高，凋亡細(xì)胞明顯增多，證實(shí)SHR疾病過程中發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)高血壓心臟損害；纈沙坦組及聯(lián)合用藥組血壓較陽性對照組明顯下降，同時(shí)凋亡細(xì)胞減少，表明降低血壓可以降低心室壁張力，從而減輕了對心肌細(xì)胞凋亡的刺激［6］。本研究顯示HGF與纈沙坦均可抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)Bcl-xl蛋白表達(dá)與降低caspase-3濃度，說明HGF與纈沙坦對心肌具有保護(hù)作用，并與Cao［7］和Yasuda［2］的研究結(jié)果基本一致，且聯(lián)合用藥后抗心肌細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于單一用藥，Bcl-xl表達(dá)明顯上調(diào)，caspase-3下降顯著。

Bcl-xl是抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白，可通過干擾caspase-3的活性從而抑制細(xì)胞凋亡［8］，也可在線粒體外膜和其他促凋亡蛋白形成異源二聚體直接維持線粒體膜的正常狀態(tài)，抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而發(fā)揮其抗凋亡的作用［9］。caspase-3參與凋亡過程的終末期，在細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑中，細(xì)胞內(nèi)死亡信號誘發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C，并形成凋亡復(fù)合，激活caspase-3降解底物使細(xì)胞凋亡［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合組HGF較HGF組升高明顯，提示應(yīng)用纈沙坦后心肌HGF表達(dá)增加［11］，并且阻斷AngⅡ通過AT1R介導(dǎo)caspase-3的活化［12］。聯(lián)合組局部升高的HGF可以顯著抑制AngⅡ及AT1受體的表達(dá)［13］，并通過C-met途徑抑制AngⅡ活化后介導(dǎo)的凋亡［14］，穩(wěn)定Bcl-xl mRNA并上調(diào)Bcl-xl的表達(dá)［7］，進(jìn)一步阻礙內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑，減少心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，HGF與纈沙坦均使SHR左心室心肌細(xì)胞凋亡減少，且聯(lián)合較單一使用能更有效抑制SHR左心室心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重構(gòu)，其作用機(jī)制可能與降壓，上調(diào)心肌局部的HGF、Bcl-xl及抑制caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

（本文圖1，2見插圖3-2）

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Effects of hepatocyte grow th factor and valsartan on myocardial apoptosis in spontaneously hypertensive rats

QIAN Qianqian，WANG Bangning，HU Zeping，SONGBing，MADongyu
（Departmentof Cardiology，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022，China）

WANGBangning，Email：wangbangning＠m(xù)edmail.com.cn

Ob jective To observe the effect of HGF combined with valsartan on myocardial apoptosis in spontaneously hypertensive rats.Methods24-old male SHRs age，14-week，were random ly divided into 4 groups：positive control group（P group，conventional breeding，with no drug intervention），HGF group（H group，the left ventricle wallswere injected with 0.1ml 5x109Pfu／mL Ad5-HGF at five different points after thoracotomy and then fed them normally for 4 weeks），valsartan group（V group，intragastric administration of valsartan 30 mgokg-1od-1 for 4 weeks），HGF plus valsartan group（HV group，the left ventricle walls were injected with 0.1ml 5x109Pfu／mL Ad5-HGF，at five different points after thoracotomy and then valsartan at a dose f 30 mgokg-1od-1was intragastrically administrated for 4 weeks），and male Wistar rats（WKY）were used as normal controls（N group，n=6）.The tailblood pressurewasmeasured once aweek before and after treatment.The ratswere sacrificed at the 4th week.Themyocardial apoptosis index wasmeasured by TUNEL，and the concentration ofmyocardial HGF and caspase-3 wasmeasured by ELASA，the level ofmyocardial Bcl-xlwas analyzed by immunohistochemistry and image analysis system.ResultsAfter 4 weeks＇treatment，blood pressure in HV group and V group significantly decreased（P＜0.05）.Compared with P group，H group，V group and HV group showed significant decrease inmyocardial apoptosis index and myocardial caspase-3 levels（P＜0.05），while increase in myocardial HGF and antimyocardial apoptosis protein Bcl-xl levels（P＜0.05）.Compared with H group or V group，HV group showed better effect.（P＜0.05）.ConclusionThe combination of HGF and valsartan have better effect on myocardial apoptosis ofSHR ventricular than HGF or valsartan alone.

Apoptosis；Rats，Inbred SHR；Hepatocyte Growth Factor；Antihypertensive Agents；Myocytes，Cardiac

R329.25；R544.1

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.03.020

2013-11-08）

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（11040606M157）

錢倩倩，碩士在讀，Email：angie＿qian＠163.com

王邦寧，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：wangbangning＠m(xù)edmail.com.cn