胡斌，田豐偉，趙建新，張秋香，王剛，張灝，陳衛(wèi)

（江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

表層蛋白（Surface Layer Protein，SLP）是一種可被蛋白酶K特異性水解，以非共價(jià)鍵與細(xì)胞壁結(jié)合的細(xì)胞包被結(jié)構(gòu)。這層蛋白結(jié)構(gòu)，其蛋白含量占細(xì)菌細(xì)胞總蛋白的10%～15%，用提取劑去除后，菌體能夠重新組裝SLP結(jié)構(gòu)[1]。研究表明，SLP的功能除了保護(hù)和維持細(xì)胞形態(tài)之外，還是胞外酶結(jié)合位點(diǎn)、菌體與細(xì)胞粘附表面識(shí)別位點(diǎn)，還有可能是致病菌的毒力因子[2]。SLP的多種功能特性引起了微生物學(xué)和材料學(xué)的廣泛關(guān)注。

嗜酸乳桿菌NCFM是一株分離自人體腸道且全基因組測(cè)序的益生菌[3]，目前已應(yīng)用在嬰兒配方乳粉、酸奶和液態(tài)乳制品中。NCBI檢索得到該菌株共有3個(gè)SLP 基因，即 slpA （Gene ID: 3252774）、slpB （Gene ID: 3252692）和 slpX （Gene ID: 3253051），SlpA、SlpB和SlpX蛋白分子量分別為46、47、51kD[4]，并已有學(xué)者對(duì)其性質(zhì)展開研究，發(fā)現(xiàn)SLP可以調(diào)控人體腸道免疫樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞功能[5]；敲除slpA基因后，嗜酸乳桿菌NCFM對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附力下降84%[6]。

作為一株全基因組測(cè)序益生菌的功能結(jié)構(gòu)，嗜酸乳桿菌NCFM的SLP具備了序列清晰，應(yīng)用安全的優(yōu)點(diǎn)，是極具潛力的研究和應(yīng)用對(duì)象，提高 SLP提取效率是對(duì)其深入研究的技術(shù)前提。另外，良好的胃酸、膽鹽耐受力以及對(duì)腸道上皮細(xì)胞的粘附力是嗜酸乳桿菌NCFM作為益生菌的必要前提。利用SLP的再生能力，本研究為SLP與嗜酸乳桿菌NCFM菌體酸、膽鹽耐受能力和粘附性能的關(guān)系提供了直接證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌NCFM（Lactobacillus acidophilus NCFM） 江南大學(xué)食品生物技術(shù)研究中心保藏；HT-29細(xì)胞 中科院上海細(xì)胞研究所；MRS液體培養(yǎng)基115℃濕熱滅菌20min；MRS固體培養(yǎng)基 在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加1.5%瓊脂，115℃濕熱滅菌20min；3號(hào)膽鹽 美國(guó)Difco公司；氯化鋰 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 小牛血清 中國(guó)四季青公司。

紫外可見分光光度計(jì) UNICO2000，美國(guó)UNICO公司；pH計(jì) 320-S，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；滅菌器 MLS-3750，SANYO公司；離心機(jī) Avanti J-26xp，美國(guó) BECKMAN 公司；凝膠成像系統(tǒng) Geldoc 2000，BIO-RAD公司；蛋白電泳儀 Powerpac，BIO-RAD公司；顯微鏡 DMB5，Motic China公司；培養(yǎng)箱 BD150L，德國(guó)BINGD公司；厭氧工作站 DG250，英國(guó)Whitley公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌的活化與培養(yǎng) 取-20℃甘油管保存的嗜酸乳桿菌種于 5mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h后，再按2% （v/v）的接種量活化于10mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)20h后實(shí)驗(yàn)待用。

1.2.2 菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化兩代后的嗜酸乳桿菌按2% （v/v）的接種量接種至液體 MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，每 2h取樣，用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在600nm波長(zhǎng)的OD值，每批實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 LiCl提取SLP 取37℃厭氧培養(yǎng)20h 后的菌液，10000g離心10min收集菌體，將菌體重懸于5mol/L的LiCl進(jìn)行處理，不同的溫度和時(shí)間處理后，再 30000g，離心 15min，取上清液進(jìn)行 SDS-PAGE蛋白電泳[7]。在上清中加入蛋白酶K處理SLP提取液，再用SDS-PAGE驗(yàn)證提取液中的蛋白是否能被蛋白酶K特異性降解。

1.2.4 嗜酸乳桿菌SLP的再生 在菌體沒有失活的前提下，被破壞的SLP能夠重新恢復(fù)是SLP的重要特性。將提取過SLP的嗜酸乳桿菌菌體重新用MRS液體培養(yǎng)基重懸，37℃厭氧培養(yǎng)，每4h取樣一次，35℃下用5mol/L LiCl提取SLP 20min，再用SDS-PAGE分析SLP的變化。

1.2.5 菌體耐酸、耐膽鹽能力測(cè)試 分別用pH2.0的鹽酸溶液（121℃滅菌20min）和含0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基（115℃滅菌20min），在37℃下處理菌體1h，傾注平板法計(jì)數(shù)酸液和膽鹽處理前后活菌數(shù)，計(jì)算存活率，每批實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以存活率評(píng)估菌體在模擬胃酸環(huán)境中的耐酸能力和模擬膽汁環(huán)境中的耐膽鹽能力。

1.2.6 菌體對(duì)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞 HT-29的粘附能力測(cè)試[8]嗜酸乳桿菌懸液的制備：離心收集實(shí)驗(yàn)待用的菌體，清洗后用PBS（pH7.2）重懸，調(diào)整菌體濃度至108CFU/mL左右。嗜酸乳桿菌對(duì)HT-29細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)：用胰蛋白酶消化培養(yǎng)好的 HT-29細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×105個(gè)/mL左右，接種于置有18×18mm無(wú)菌蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2、95%濕度孵育培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，用滅菌 PBS 緩沖液漂洗細(xì)胞 3次，然后每孔加入lmL不含血清和雙抗的1640培養(yǎng)液和 1mL上述制備好的菌懸液，輕搖混勻后，37℃、5%CO2、95%濕度下孵育 2h。孵育完成后用PBS清洗5次，除去各孔中未粘附的菌體，然后用無(wú)水甲醇固定30min。清洗甲醇后，對(duì)蓋玻片上的菌體進(jìn)行革蘭氏染色，干燥后在顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì) 100個(gè)細(xì)胞上粘附的菌體個(gè)數(shù)，以每個(gè)細(xì)胞上粘附菌體的平均數(shù)為粘附指數(shù)，每個(gè)蓋玻片重復(fù)2遍。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌NCFM生長(zhǎng)狀態(tài)

將嗜酸乳桿菌NCFM接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，每隔2h取樣測(cè)600nm下的吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見圖1，嗜酸乳桿菌在20h后進(jìn)入穩(wěn)定期，故取培養(yǎng)20h的菌液來(lái)提取SLP。

圖1 嗜酸乳桿菌NCFM生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus acidophilus NCFM

2.2 LiCl提取嗜酸乳桿菌SLP的驗(yàn)證

SLP能夠被蛋白酶K特異性降解，因此可以用于驗(yàn)證LiCl處理的菌液上清中是否含有SLP。室溫下用5mol/L LiCl處理菌體10min后，將離心所得上清液分為2份，其中一份加入適量蛋白酶K，處理10min后，將2份上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果如圖2。

圖2 LiCl提取 SLP SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE of SLP extraction with LiCl

圖2中M為低分子量Marker，1泳道和2泳道中電泳樣品分別蛋白酶K未處理和處理過的LiCl提取上清液。泳道1中45kD左右處可見一條蛋白條帶，而在泳道2中，該條帶消失，因此，可以判斷用LiCl可以提取嗜酸乳桿菌NCFM的SLP，條帶分子量在47kD附近，這與文獻(xiàn)[4]報(bào)道結(jié)果相符合。

2.3 LiCl提取SLP條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別在 0、15、25、35、45℃下,用 5mol/L LiCl對(duì)嗜酸乳桿菌 NCFM的SLP提取相同時(shí)間。提取效果用SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證，如圖3所示。

圖3 不同溫度下提取SLPSDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of SLP extraction at different temperatures

圖3表明，隨著提取溫度的增加，蛋白條帶顏色加深，即蛋白提取效果越好，但是45℃的條帶淺于35℃的條帶，可能是由于在45℃下嗜酸乳桿菌NCFM的生長(zhǎng)受到限制，SLP的產(chǎn)生也同樣受限。因此，取 35℃為最優(yōu)提取溫度。

隨后，本實(shí)驗(yàn)研究了在35℃下分別用5mol/L LiCl處理0、10、20、30、40min的提取效果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同時(shí)間提取SLPSDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of SLP extraction at different durations

圖4表明，隨著提取時(shí)間的增加，蛋白條帶顏色逐漸加深，但是當(dāng)時(shí)間增加到20min以后，條帶顏色加深趨緩，說明繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間不能顯著提高SLP提取效率。因此，取20min作為嗜酸乳桿菌NCFM SLP的最優(yōu)提取時(shí)間 。

2.4 嗜酸乳桿菌SLP的再生

用1.2.4中的方法檢驗(yàn)嗜酸乳桿菌NCFMSLP的再生性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 嗜酸乳桿菌NCFM SLP的再生Fig.5 SLP reformation of L. acidophilus NCFM

圖5可見，將用LiCl提取過SLP后的菌體重懸于 MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)，SLP的含量不斷提高，利用凝膠成像儀分析軟件分析，電泳條帶密度在8h后達(dá)到峰值。由此可以說明，用5mol/L LiCl提取嗜酸乳桿菌 SLP后，菌體沒有失活，SLP能夠在菌體培養(yǎng)過程中重新恢復(fù)，維持細(xì)胞功能。

2.5 SLP與嗜酸乳桿菌NCFM菌體耐酸、耐膽鹽能力的關(guān)系

SLP是一種細(xì)胞封裝結(jié)構(gòu)，由它形成了細(xì)胞最外層的蛋白層，是菌體抵御外界惡劣條件的生理屏障。結(jié)合 SLP的再生性，我們研究了 SLP與嗜酸乳桿菌NCFM菌體耐酸、耐膽鹽能力的關(guān)系。

表1為將菌體SLP用5mol/L LiCl除去后，用新鮮MRS液體培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)，使SLP再生，每4h取樣進(jìn)行菌體的耐酸和耐膽鹽測(cè)試結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著SLP的再生，菌體的耐酸能力和耐膽鹽能力不斷提高。存活率數(shù)據(jù)分析可得，相對(duì)于耐酸能力，SLP對(duì)菌體耐膽鹽能力的影響更大。膽鹽是一種生物表面活性劑，可以破壞微生物的膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞膜泄露引起細(xì)胞死亡[9]，SLP包裹在細(xì)胞膜外部，形成生理屏障，可以抵御膽鹽對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用，所以SLP結(jié)構(gòu)的完整對(duì)菌體的耐膽鹽能力有顯著地正面影響。

表1 SLP再生過程中菌體耐酸、耐膽鹽能力變化Table 1 Acid and bile resistance changing during SLP reformation

2.6 SLP與嗜酸乳桿菌NCFM對(duì)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞HT-29粘附能力的關(guān)系

有報(bào)道稱，SLP為乳酸菌提供了與腸道上皮細(xì)胞粘附的粘附位點(diǎn)。HT-29細(xì)胞系具有成熟腸上皮細(xì)胞的特性，可以較好的模擬人體腸道環(huán)境。因此，SLP再生過程中嗜酸乳桿菌與 HT-29粘附能力的變化，可用以解釋兩者之間的關(guān)系。圖6為菌體在新鮮MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、4、8h，SLP再生過程中與HT-29細(xì)胞的粘附照片。

圖6 顯微鏡觀察菌體對(duì)HT-29細(xì)胞粘附（1000×）Fig.6 Adhesion of L. acidophilus strains to HT-29 cells as observed by Gram staining under a light microscope (1000 ×)

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)得到SLP再生的0、4、8h，HT-29細(xì)胞的菌體粘附指數(shù)分別為0.33±0.03、10.72±0.69、18.54±1.26。顯微鏡觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果可得：用 LiCl去除SLP后，嗜酸乳桿菌NCFM對(duì)HT-29細(xì)胞的粘附指數(shù)下降至1以下，即大部分菌體不能粘附到細(xì)胞上。4h后，隨著SLP的再生，菌體對(duì)HT-29細(xì)胞的粘附能力也不斷增加，8h后，每個(gè)HT-29細(xì)胞能粘附上18.54個(gè)菌體，粘附能力較0h顯著上升。由此可得，嗜酸乳桿菌 NCFM 的 SLP在菌體對(duì)結(jié)腸癌上皮細(xì)胞HT-29的粘附過程中扮演了重要角色。

3 結(jié)論

SLP是公認(rèn)的具有包被功能的生物大分子，能夠自重組并維持微生物的形態(tài)，還可作為細(xì)胞粘附和表面識(shí)別的重要結(jié)構(gòu)等[10]，這些功能不但擁有生物學(xué)研究?jī)r(jià)值還有材料學(xué)應(yīng)用價(jià)值。嗜酸乳桿菌 NCFM作為一株已被全基因測(cè)序的益生菌，其SLP序列清晰，是理想的研究對(duì)象。

通過優(yōu)化提取方法，本研究在提高了 SLP的提取效率的同時(shí)，還保證了菌體活力。耐酸、耐膽鹽及對(duì)腸道上皮細(xì)胞的粘附能力是益生菌所必備的生理功能，利用SLP的再生能力，實(shí)驗(yàn)證明了嗜酸乳桿菌NCFM的耐酸耐膽鹽以及對(duì)腸道上皮細(xì)胞的粘附能力都隨SLP的再生，不斷得到恢復(fù)。通過直接證據(jù)證明了SLP的完整對(duì)維持菌體相關(guān)生理功能的重要作用，為嗜酸乳桿菌NCFM及其SLP的后續(xù)研究提供了理論依據(jù)。

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