張 騰，田建軍，李梓媛，賈原博，賀銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

群體感應(yīng)即微生物群體感應(yīng)(quorum sensing，簡稱QS)即細(xì)菌隨著菌體密度的增大和生長周期的變化分泌出一種或幾種化學(xué)信號分子，通過這些信號分子進行種內(nèi)或種間交流，協(xié)調(diào)群體行為［1］。目前發(fā)現(xiàn)的群體感應(yīng)信號分子大致有三類，其中第二類信號分子AI-2(Autoinducer-2)作為普遍存在于革蘭氏陰性和陽性菌中的一種信號分子在微生物群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究領(lǐng)域備受人們的關(guān)注。

1993 年，Bassler［1］等最初在哈維氏弧菌(Vibro harveyi)中發(fā)現(xiàn)AI-2作為信號分子調(diào)控V.harveyi的生物發(fā)光現(xiàn)象，這是AI-2首次被人們所知。luxS基因作為細(xì)胞內(nèi)合成AI-2信號分子的關(guān)鍵基因，經(jīng)常被用作證明AI-2信號分子的存在。在發(fā)現(xiàn)信號分子AI-2之后的十幾年里，陸續(xù)在大約70多個種屬的微生物基因組中發(fā)現(xiàn)luxS基因的同源序列并檢測到信號分子 AI-2［2］。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，AI-2/LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)在很多種屬微生物的生物膜形成過程中均起到至關(guān)重要的作用。在嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)中l(wèi)uxS的突變菌株由于不產(chǎn)生AI-2信號分子，其生物膜的合成受到了影響，與野生型相比對腸上皮細(xì)胞的粘附性下降了58%［3］。糞腸球菌V583(Enterococcus faecalis V583)在外源添加AI-2信號分子之后，其生物膜的合成量增加了23%［4］。變形鏈球菌UA159(Streptococcus mutans UA159)的 luxS基因突變株與野生型相比包括與生物膜形成相關(guān)的大量基因表達(dá)量均有所下調(diào)［5］。

植物乳桿菌HE-1分離自內(nèi)蒙古錫盟地區(qū)的酸馬奶酒，本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)該菌種具有產(chǎn)抑菌物質(zhì)、發(fā)酵大量產(chǎn)酸和產(chǎn)游離氨基酸能力強等優(yōu)秀的特性，具有作為益生菌開發(fā)腸道益生產(chǎn)品的潛質(zhì)。本實驗對植物乳桿菌HE-1生物膜形成與AI-2/LuxS群體感應(yīng)相關(guān)關(guān)系進行研究，以期找到其生物膜形成與AI-2信號分子產(chǎn)生二者之間的規(guī)律，為利用AI-2/LuxS群體感應(yīng)調(diào)控生物膜大量生成打下理論基礎(chǔ)，進而為植物乳桿菌HE-1日后被開發(fā)利用為腸道益生菌做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VICTOR X3 Multilabel Plate Reader 美國Perkin Elmer儀器有限公司;Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;96孔酶標(biāo)板 美國Corning公司;MRS培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱公司。

2216海生菌培養(yǎng)基 青島海博公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒 北京天根公司;rTaq酶 Takara公司;氨芐抗性pMD19-T質(zhì)粒 北京全式金公司;引物合成與測序服務(wù) 北京中美泰和公司。

1.2 菌種的保藏和活化

將植物乳桿菌HE-1接種于MRS培養(yǎng)基中活化三代，在第三代生長到對數(shù)期的發(fā)酵液中加入甘油至終濃度為20%，分裝入1.5mL離心管置于-20℃冰箱進行保藏。每次使用按1%的接種量接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中，連續(xù)活化三代可用于實驗。Vibro harveyi BB170使用2216海生菌培養(yǎng)基活化三代，在第三代生長到對數(shù)期的發(fā)酵液中加入甘油至濃度為20%，分裝入1.5mL離心管置于-80℃冰箱進行保藏。每次使用按1%的接種量接種于新鮮AB培養(yǎng)基［6］中，過夜培養(yǎng)后可用于實驗。

1.3 AI-2信號分子的檢測

活化三代后的植物乳桿菌HE-1按1%接種量接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中。從3h至30h，每隔3h取5mL發(fā)酵上清液，600r/min離心5min后使用0.22μm過濾器過濾，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅc此同時每隔兩小時測定一次OD600nm吸光度值并繪制生長曲線。

發(fā)光檢測實驗方法據(jù)文獻(xiàn)［6］得到。30℃條件下，將Vibro harveyi BB170接種于AB培養(yǎng)基中有氧過夜培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基OD600nm吸光度值為1左右時，按照1∶5000比例稀釋到新鮮AB培養(yǎng)基中，混勻備用。將上述制備好的菌株HE-1各時間點發(fā)酵上清液與稀釋后含有Vibro harveyi BB170的 AB培養(yǎng)基按照1∶100的比例混勻。在AB培養(yǎng)基陰性對照熒光強度最低點時(大約混勻后3.5h)使用多功能酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光模式對各樣品熒光強度進行測定，每個樣品3個平行，每個平行均取復(fù)孔。得到各樣品熒光強度后計算其相對熒光強度(相對熒光強度=樣品熒光強度/AB陰性對照)。

1.4 生物膜形成的檢測

生物膜檢測實驗方法參見文獻(xiàn)［5］。簡而言之，生物膜形成裝置為96孔酶標(biāo)板，每孔加入200μL新鮮MRS培養(yǎng)基，按照1%比例接種菌株HE-1至每個孔中，37℃靜置培養(yǎng)。分別于 6、12、18、24、30h 將對應(yīng)孔中發(fā)酵液倒出，使用生理鹽水小心沖洗微孔，重復(fù)3次。待酶標(biāo)板晾干之后使用濃度為1%的結(jié)晶紫染液對微孔染色15min，之后再使用生理鹽水小心沖洗3次。再次晾干之后使用200μL乙醇和丙酮體積比為4∶1的脫色劑對附著于生物膜上的結(jié)晶紫染液進行脫色后，酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀OD595nm下測定吸光度值，記錄數(shù)值，每個時間點三個平行。

1.5 DNA的提取與luxS基因的擴增

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒對植物乳桿菌HE-1的基因組DNA進行提取，提取方法詳見試劑盒說明書。上述提取出的DNA作為模板，luxS基因擴增使用引物為luxS-F(5'-ATGGCTAAAGTAGAAAGTT-3')和 luxS-R(5'-CTATTCAACGACTTTGCGT-3')。PCR反應(yīng)體系為:0.25μL Taq;5μL 10×PCR Buffer;4μL dNTP Mixture(各 2.5mmol/L);1μL 模板(約50ng/μL);正反向引物各加 0.5μL(20μmol/L);加去離子水補齊體系至50μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;每個循環(huán)中在94℃下變性30min，55℃下退火30min，72℃延伸1min;30個循環(huán);最后72℃補充延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的條帶在500bp左右。使用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收，膠回收產(chǎn)物與pMD19-T質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑和卡那抗性篩選后，選出陽性克隆進行菌落PCR鑒定，將鑒定結(jié)果正確的單克隆菌株送測序。植物乳桿菌HE-1的luxS基因片段已在Genbank上注冊，登錄號為KC914585。

1.6 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測定菌株的 luxS基因序列，與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的luxS序列進行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。后從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中選取不同標(biāo)準(zhǔn)菌種luxS基因序列。將參比序列與測定菌株的 luxS序列，分別用Clustal1.8進行校準(zhǔn)排齊，使用MEGA5.1的最大似然法(maximum likelihood，ML)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AI-2信號分子檢測及與生物膜形成之間的相關(guān)關(guān)系

從圖1的折線趨勢可以看出，AI-2信號分子從菌株HE-1培養(yǎng)到9h時開始產(chǎn)生，在18h處的生成量達(dá)到最大值，相對熒光強度達(dá)到62.7。之后由AI-2信號分子誘導(dǎo)的熒光強度開始較為迅速的減弱，在培養(yǎng)至30h的發(fā)酵上清液中則基本沒有AI-2信號分子存在。

圖1中柱狀圖即為不同培養(yǎng)時間菌株HE-1生物膜的生成量。從12h處可以較為顯著的檢測出生物膜已經(jīng)開始生成，在12h到18h之間生物膜的合成活動最為旺盛，18h處由生物膜結(jié)合而釋放出來的結(jié)晶紫染液的OD595nm吸光度值達(dá)到1.337。從18h到30h，生物膜的合成活動基本停止，生物膜的總量也趨于穩(wěn)定。

圖1 菌株HE-1生物膜合成與AI-2信號分子生成二者之間的關(guān)系Fig.1 The relationship between the production of AI-2 and the biofilm formation

結(jié)合菌株HE-1的AI-2信號分子產(chǎn)生規(guī)律和生物膜合成的趨勢可以看出，AI-2信號分子在12h到18h達(dá)到生成的高峰期，巧合的是與此同時生物膜也進入合成的高峰期，二者的生成量在時間點上非常相似與吻合。結(jié)合圖2可以看出，二者均為培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期約12h處開始大量產(chǎn)生，到18h時生成量基本達(dá)到最大值。不同的是，AI-2在達(dá)到最大生成量之后在發(fā)酵上清液中的數(shù)量開始迅速減少，而生物膜的存在量較為穩(wěn)定。在鼠李乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus)中，luxS突變株的生物膜合成量不到野生型菌株的20%，當(dāng)往luxS缺陷株轉(zhuǎn)化帶有啟動子的luxS序列之后，生物膜的形成得到很好的回補，證明luxS基因在Lactobacillus rhamnosus GG生物膜的形成中起到關(guān)鍵的作用［7］。故從前人研究成果和以上結(jié)果可以看出，在菌株HE-1中AI-2生成的時間趨勢與生物膜合成的趨勢有較大的相關(guān)性，并且產(chǎn)生時間基本都在穩(wěn)定期初期，可以推測生物膜的合成與AI-2的調(diào)控作用有較為密切的關(guān)系。

圖2 菌株HE-1不同培養(yǎng)時間OD600nm吸光度值Fig.2 The OD600nmabs of HE-1 in different incubation time

2.2 luxS基因的擴增及同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

以植物乳桿菌HE-1基因組DNA作為模板，使用引物luxS-F和luxS-R進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在500bp左右有目的條帶，與NCBI公布的植物乳桿菌luxS基因大小一致。

圖3 luxS基因的PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplication of the luxS gene

如圖4可知，植物乳桿菌HE-1的luxS序列與金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Enterococcus faecalis V583和大腸桿菌 O103∶H2(Escherichia coli O103∶H2)等菌株的luxS序列同源性均小于60%。而與其他乳桿菌屬的luxS基因序列同源性均大于66%，其中與 Lactobacillusplantarum WCFS1和Lactobacillus plantarum ZJ316菌株luxS基因的同源性分別為99.4%和99%。由圖5可以看出，不同菌種的luxS基因序列的同源性進化距離較遠(yuǎn)，進化樹中有3個大類群，乳桿菌屬所有l(wèi)uxS基因均在第一類群中，其中菌株HE-1、Lactobacillus plantarum WCFS1和Lactobacillus plantarum ZJ316均在最上端小分支中，進化距離很相近。故可知植物乳桿菌HE-1的luxS基因是從乳桿菌屬親緣關(guān)系較近的菌種進化而來，并與植物乳桿菌同源性最高。

圖4 菌株HE-1 luxS基因同源性分析Fig.4 luxS gene homologous analysis of HE-1

圖5 菌株HE-1 luxS基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建Fig.5 Phylogenetic tree of HE-1 constructed based on luxS sequence analysis

luxS基因是原核微生物的獨有基因，它翻譯出的蛋白LuxS作用于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代謝途徑的下游，LuxS蛋白普遍被人們認(rèn)為用來合成AI-2信號分子。故對luxS基因進行擴增并分析其同源性，可以從分子生物學(xué)的角度進一步驗證AI-2信號分子的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

3.1 實驗首次驗證了在Lactobacillus plantarum中，生物膜的形成與AI-2的生成二者之間有著密切的關(guān)系。通過檢測菌株HE-1在培養(yǎng)不同時間點AI-2信號分子的產(chǎn)生量和不同時間點生物膜的形成量，發(fā)現(xiàn)二者之間在開始產(chǎn)生的時間和數(shù)量上都非常相似和吻合，故推測菌株HE-1生物膜的形成與AI-2/LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)有較為密切的關(guān)系。

3.2 成功擴增出植物乳桿菌HE-1的luxS基因，同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與已知植物乳桿菌luxS基因同源性高達(dá)99%以上，從分子生物學(xué)角度驗證了植物乳桿菌HE-1可以產(chǎn)生AI-2信號分子。

［1］Melissa B M，Bonnie L B.Quorum sensing in bacteria［J］.Annual Review of Microbiology，2001，55(1):165-199.

［2］Colin A L，Tobin J D，Kim D J.Interspecies and interkingdom communication mediated by bacterial quorum sensing［J］.Chemical Society Reviews，2008，37(7):1337-1346.

［3］Buck B L，Azcarate-Peril M A，Klaenhammer T R.Role of autoinducer-2 on the adhesion ability of Lactobacillus acidophilus［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，107(1):269-279.

［4］Shao C L，Shang W，Yang Z，et al.Lux S-Dependent AI 2 Regulates Versatile Functions in Enterococcus faecalis V583［J］.Journal of Proteome Research.2012，11(9):4465?4475.

［5］Inigo L，Arana A T，Jaione V，et al.The Enterococcal Surface Protein，Esp，IsInvolved in Enterococcus faecalis Biofilm Formation［J］.Applied and Environment Microbiology.2001，67(10):4538-4545.

［6］張騰，賀銀鳳.堅強腸球菌SQ-3-2基于LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子AI-2的檢測及方法優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，29(2):168-173.

［7］Vanderleyden J，Lebeer S，Keersmaecker S C J De，et al.Functional Analysis of luxS in the Probiotic Strain Lactobacillus rhamnosus GG Reveals a Central Metabolic Role Important for Growth and Biofilm Formation［J］.Journal of Bacteriology，2007，189(3):860-871.