尤玲玲，陳永慧，劉金福，靳曉明，馮 超

(1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384;

2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384)

糖尿病是一種全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的常見內(nèi)分泌代謝疾病，有95%的糖尿病患者為Ⅱ型糖尿?。?］。Ⅱ型糖尿病是一種復(fù)雜的多基因疾病，胰島β細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗是其發(fā)病的兩個主要原因［2］。體內(nèi)胰島素對肝臟、脂肪和肌肉三大主要靶組織都有影響［3］。胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病、肥胖癥、高血壓、血脂異常和心血管疾病的多元綜合癥［4］。胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于其生物學(xué)效應(yīng)的一種病理學(xué)狀態(tài)，表現(xiàn)為胰島素促進(jìn)外周組織攝取和利用葡萄糖以及抑制肝糖輸出的效應(yīng)減弱［5］。肝臟及外周組織是胰島素作用的靶組織，是胰島素抵抗產(chǎn)生的主要部位。

建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型，不僅可廣泛用于細(xì)胞水平探討胰島素抵抗形成的機(jī)制和葡萄糖代謝障礙的病理、生理學(xué)環(huán)節(jié)，而且便于篩選具有改善胰島素抵抗活性的成分。HepG2細(xì)胞來源于肝細(xì)胞，系一種表型與肝細(xì)胞極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株［6］，在高劑量的胰島素條件下，HepG2細(xì)胞表面胰島素受體的數(shù)目下降，下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時間呈正相關(guān)［7］，因此HepG2是體外研究胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制和降糖活性物質(zhì)篩選的理想細(xì)胞模型。

苦瓜別名涼瓜、錦荔枝、癩瓜，具有清熱解毒、滋養(yǎng)強(qiáng)壯、明目和解勞乏之功效［8］。近年來，對苦瓜成分的研究報道很多且較深入，從苦瓜的果實(shí)、根、莖、葉、花及種子等部位中分離出苦瓜皂苷、多糖、蛋白質(zhì)和多肽等多種化學(xué)成分，并證明其具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、提高免疫力等多種功效［9］。本文以人肝癌HepG2細(xì)胞為研究載體，建立最佳胰島素抵抗模型，探究苦瓜皂苷對胰島素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2細(xì)胞株 北京腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫;牛胰島素、DMSO Sbasebio公司;DMEM高糖培養(yǎng)基Hyclone公司;胎牛血清 天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司;青-鏈霉素美國Gibco公司;胰蛋白酶(1∶250) 天津博美科生物技術(shù)有限公司;葡萄糖測定試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司;苦瓜皂苷 我校食品營養(yǎng)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，純度:58%;其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

TD5A-WS型臺式低速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;IX51倒置相差熒光顯微鏡 日本Olympus公司;超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Forma公司;Bio-Tek ELX800型全自動酶標(biāo)儀 美國寶特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用含15%胎牛血清，1‰青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型(HepG2/IR)的建立

1.2.2.1 胰島素添加濃度的確定 將HepG2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以105個/mL細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔 100μL，于 37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞12h，加入新鮮配制的胰島素(終濃度為 0.5、5、10、15、30、60、150、300μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h，每組 6個復(fù)孔，同時設(shè)立正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照，用葡萄糖氧化酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，計算對照組與不同胰島素濃度組細(xì)胞的葡萄糖消耗量，選擇葡萄糖消耗量最大，即胰島素敏感性最強(qiáng)時胰島素的濃度為最佳添加濃度。

1.2.2.2 確定胰島素作用細(xì)胞的最佳時間 確定了最佳胰島素濃度后，設(shè)對照組和作用時間組(12、24、36、48h)，依1.2.2.1方法向孔板中加入最佳濃度胰島素溶液，分別作用細(xì)胞 12、24、36、48h，計算正常組與各作用時間組的細(xì)胞葡萄糖消耗量差值，選擇葡萄糖消耗量差值最大的作用時間為胰島素作用最佳時間。

依照上述方法分別得出胰島素作用最佳濃度和作用時間，由此建立適宜的高濃度胰島素誘導(dǎo)的HepG2/IR細(xì)胞模型。

1.2.3 苦瓜皂苷干預(yù)HepG2/IR細(xì)胞

1.2.3.1 苦瓜皂苷對HepG2/IR葡萄糖消耗量的影響 以細(xì)胞密度為2×105個/mL接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)12h，分別設(shè)立HepG2細(xì)胞陰性對照組，HepG2/IR模型組、鹽酸吡格列酮陽性對照組(4μg/mL)、苦瓜皂苷干預(yù)組(終濃度為 10、100、200、300、500、1000、2000μg/mL)。陰性對照組和 HepG2/IR模型組中加入50μL DMEM培養(yǎng)液，HepG2/IR模型組、陽性對照組以及苦瓜皂苷干預(yù)組每孔加入50μL胰島素溶液至終濃度30μg/mL，孵育36h后，陽性對照組中加入50μL鹽酸吡格列酮溶液(終濃度為4μg/mL)，苦瓜皂苷干預(yù)組分別加入50μL終濃度為 10、100、200、300、500、1000、2000μg/mL 的苦瓜皂苷溶液，孵育12h，3600r/min離心10min，按葡萄糖試劑盒測定方法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

葡萄糖含量(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)品濃度×［(OD樣品管-OD空白管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管-OD空白管)］

1.2.3.2 MTT測定HepG2/IR細(xì)胞活性 棄去96孔板中苦瓜皂苷干預(yù)后的培養(yǎng)液，每孔加入MTT(終濃度5mg/mL)溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)板中溶液，每孔加入100μL DMSO終止反應(yīng)，充分振搖，利用酶標(biāo)儀檢測波長490nm下吸光度值［10］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素差異性分析以及多重比較組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰島素濃度和作用時間對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

2.1.1 不同濃度的胰島素對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 分別設(shè)立對照組和胰島素劑量組(0.5、5、15、30、60、150、300μg/mL)作用 HepG2 細(xì)胞 12h 后測得細(xì)胞葡萄糖消耗情況見表1。當(dāng)胰島素濃度由15μg/mL增加到300μg/mL時，與正常組相比，葡萄糖含量均有顯著降低，結(jié)合考慮葡萄糖消耗率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)胰島素濃度達(dá)30μg/mL時，葡萄糖消耗率最高達(dá)18.28%。說明30μg/mL的胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗程度達(dá)到最大。

表1 不同濃度的胰島素對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗情況的影響Table 1 Effect of different concentration insulin to the glucose consumption of HepG2

2.1.2 胰島素作用不同時間對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 設(shè)立不同作用時間組(12、24、36、48h)的同時，設(shè)立相應(yīng)的各時間點(diǎn)的陰性對照組，孵育好的細(xì)胞加入胰島素至終濃度30μg/mL，分別作用12、24、36、48h，測得細(xì)胞葡萄糖消耗情況見表2。隨著胰島素作用時間的延長，不同作用時間組細(xì)胞葡萄糖的消耗均低于正常組，分別降低14.07%，17.76%，20.28%，18.07%。當(dāng)胰島素作用細(xì)胞36h時與其相應(yīng)的陰性組比較，葡萄糖消耗差異最大達(dá)20.28%，差異極顯著(Ap＜0.01);48h時葡萄糖消耗量差值也較大，且差異極顯著(Ap＜0.01)，但考慮到胰島素作用HepG2細(xì)胞的時間過長，中間又沒有換液，其細(xì)胞活力可能會有所下降。因此，本實(shí)驗(yàn)胰島素誘導(dǎo)細(xì)胞HepG2建立胰島素抵抗模型的最佳作用時間為36h，最佳胰島素濃度為30μg/mL，同時也印證了HepG2細(xì)胞株是國內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的研究胰島素抵抗機(jī)制的細(xì)胞模型［11］。

表2 胰島素不同作用時間對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗情況的影響Table 2 Effect of different insulin effect time to the glucose consumption of HepG2 cells

2.2 苦瓜皂苷對HepG2/IR細(xì)胞葡萄糖消耗量及細(xì)胞活性的影響

2.2.1 不同濃度的苦瓜皂苷對HepG2/IR細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 成功建立HepG2/IR細(xì)胞模型后，設(shè)立不同濃度的苦瓜皂苷作用HepG2/IR細(xì)胞，測定葡萄糖消耗情況見表3。與HepG2/IR模型對照組相比較，隨著苦瓜皂苷濃度的增大，葡萄糖含量均有所回升，說明苦瓜皂苷可以在一定程度上緩解胰島素抵抗，其中300、500μg/mL劑量的苦瓜皂苷作用顯著(bp＜0.05，)。與鹽酸吡格列酮陽性對照組相比較，300、500μg/mL劑量的苦瓜皂苷作用顯著(cp＜0.05)。同時結(jié)合考慮葡萄糖消耗率，300μg/mL劑量的苦瓜皂苷作用效果最理想。

表3 不同濃度的苦瓜皂苷對HepG2/IR細(xì)胞葡萄糖消耗情況的影響Table 3 Effect of different concentration bitter melon saponin to The glucose consumption of HepG2/IR

當(dāng)苦瓜皂苷濃度高于300μg/mL時，葡萄糖消耗量整體呈現(xiàn)下降趨勢，盡管葡萄糖消耗量隨著濃度的增加而減少，但與HepG2/IR模型組相比較，葡萄糖消耗量仍有所提高，說明苦瓜皂苷還是在不同程度上促進(jìn)了HepG2/IR細(xì)胞消耗葡萄糖。

2.2.2 苦瓜皂苷對HepG2/IR細(xì)胞活性的影響 如圖1所示，與陰性對照組相比，HepG2/IR模型組，鹽酸吡格列酮陽性對照組以及苦瓜皂苷組的細(xì)胞活性均低于陰性對照組，這是因?yàn)楦邼舛鹊囊葝u素降低了HepG2細(xì)胞的活性;苦瓜皂苷組與陰性對照組相比較，苦瓜皂苷濃度由10μg/mL增加至300μg/mL時，隨著皂苷濃度的增加，細(xì)胞的活性逐漸提高，達(dá)到300μg/mL時，細(xì)胞活性顯著提高，吸光度值達(dá)0.226，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);高于300μg/mL時，HepG2/IR細(xì)胞的活性反而降低了，可能是過高劑量的苦瓜皂苷存在毒性效應(yīng)，這一點(diǎn)與葡萄糖消耗量實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 不同濃度的苦瓜皂苷對HepG2/IR細(xì)胞活性的影響Fig 1. The effect of different concentration bitter melon saponin to activity of HepG2/IR

3 結(jié)論

本文以HepG2細(xì)胞為研究對象，采用一系列不同濃度的胰島素作用HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)30μg/mL胰島素作用細(xì)胞36h時產(chǎn)生的胰島素抵抗效果最強(qiáng)。苦瓜皂苷濃度在低于300μg/mL時，隨著濃度的增大，可改善由高濃度胰島素帶來的細(xì)胞活性降低。當(dāng)苦瓜皂苷濃度高于300μg/mL時，隨著濃度的增大對HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的劑量毒性效應(yīng)增加，抑制了細(xì)胞的生長。可見，在一定的濃度范圍內(nèi)，300μg/mL苦瓜皂苷可以顯著改善HepG2/IR細(xì)胞的活性，同時提升葡萄糖消耗量，起到較好的降糖效果。

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