曹佳，賀思佳，徐雷鳴，李兆申

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)鏡診治部，上海 200092；2.第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433）

·論著·

TM4SF1對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響

曹佳1，賀思佳1，徐雷鳴1，李兆申2

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)鏡診治部，上海 200092；2.第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433）

目的研究TM4SF1對內(nèi)皮細(xì)胞體外管腔形成的影響。方法應(yīng)用qRT-PCR方法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中TM4SF1的mRNA表達量；應(yīng)用siRNA方法瞬時轉(zhuǎn)染HUVECs，采用qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染48 h與72 h后TM4SF1的沉默效果，選擇最佳的轉(zhuǎn)染時間，應(yīng)用In Vitro Angiogenesis Assay Kit觀察siControl與siTM4SF1轉(zhuǎn)染后HUVECs體外管腔形成情況。結(jié)果qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，HUVECs中表達TM4SF1的RQ值為(0.71±0.11)，已知高表達TM4SF1胰腺癌細(xì)胞株MPanc96表達TM4SF1的RQ值為(0.56±0.13)，兩種細(xì)胞中TM4SF1表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；siRNA瞬時轉(zhuǎn)染HUVECs 48 h與72 h后，TM4SF1表達分別下降了47.06%與93.14%，HUVECs瞬時轉(zhuǎn)染72 h后進行體外管腔形成實驗，通過對管腔形成情況進行評級，siControl轉(zhuǎn)染后HUVECs管腔形成情況為5級(多個閉合管狀結(jié)構(gòu)相連形成篩狀)，siTM4SF1轉(zhuǎn)染后為2級(細(xì)胞排列形成夾角)。結(jié)論TM4SF1在HUVECs中高表達，沉默TM4SF1后可以明顯抑制HUVECs的體外管腔形成，提示TM4SF1與腫瘤血管形成相關(guān)。

TM4SF1；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；管腔形成

Folkman等[1]首先提出腫瘤生長依賴腫瘤血管的形成。腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移也與腫瘤血管形成密切相關(guān)[2]，腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境間相互影響的復(fù)雜過程[3]。因此，研究與腫瘤血管生成相關(guān)的分子機制，進而研發(fā)抑制腫瘤血管生成的藥物，進而達到抑制腫瘤的生長的目的，同時對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移也起到抑制的作用。

TM4SF1(L6，L6-Ag)屬于四次跨膜蛋白L6超家族[4]，被發(fā)現(xiàn)在一些上皮來源的腫瘤中有異常高表達，如肺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌等[5-8]，在Kao等[9]研究中發(fā)現(xiàn)TM4SF1基因的表達量與肺癌鱗癌患者的生存期正相關(guān)。并且在最近的一篇報道中提示TM4SF1/PKM2與TM4SF1/ARHGDIA兩組比值與惡性胸膜間皮瘤的術(shù)后預(yù)后及生存期相關(guān)[10]。那么TM4SF1在上皮來源的腫瘤中高表達并且與預(yù)后及生存期相關(guān)，是否是通過參與腫瘤血管形成而發(fā)揮作用，本研究旨在通過干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中TM4SF1的表達，觀察其對HUVECs體外管腔形成的影響，從而初步證實TM4SF1是否參與腫瘤血管形成。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗細(xì)胞系人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞系(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購于American Type Culture Collection。

1.1.2 引物設(shè)計與合成所有定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)引物由美國Sigma公司合成。TM4SF1：上游5'-GGTTCTTTTCTGGCATCGTAGGAGGTG-3'，下游5'-CTGGCCGAGGGAATCAAGACATAGTG-3'，產(chǎn)物大小為239 bp。以18S基因作為qRT-PCR內(nèi)參，上游5'-GAGCGGTCGGCGTCCCCCAACTTC-3'，下游5'-GCGCGTGCAGCC CCGGACATCTAA-3'，產(chǎn)物序列為5'-AAGGACCACTATGTCTTGATT-3'，由QIAgen公司合成。

1.1.3 主要試劑HUVECs培養(yǎng)液的配制：500 ml MEM培養(yǎng)液(購于GIBCO?Invitrogen公司)取出95 ml，加入75 ml胎牛血清(FBS，購于GIBCO?Invitrogen公司)、5 ml丙酮酸鈉溶液(購于Sigma Aldrich公司)、5 ml維生素液(購于Fisher Scientific公司)、5 ml抗生素(購于GIBCO?Invitrogen公司)、5 ml非必須氨基酸(購于Fisher Scientific公司)，最后加入5 g堿性成纖維因子(bFGF，購于Invitrogen公司)4℃儲存。Trizol試劑、0.5%Gelatin A購于Sigma Aldrich公司，Master Mix 2×購于Promega公司，SYBR green購于Bio Rad公司，Hiperfect、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于QIAGEN公司，In Vitro Angiogenesis Assay Kit購于Chemicon(Millipore)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法應(yīng)用上述方法配制的HUVECs培養(yǎng)液，在37℃孵箱5%CO2條件下培養(yǎng)。每次傳代前，需將0.5%Gelatin A 3～4 ml鋪于培養(yǎng)皿底，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h以上，吸掉剩余的0.5%Gelatin A，方可使用。胰腺癌細(xì)胞株MPanc96常規(guī)貼壁培養(yǎng)。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR用Trizol法提取HUVECs及已知高表達TM4SF1的胰腺癌MPanc96細(xì)胞的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。利用I-cycler Real Time PCR儀同時做三個副孔進行qRT-PCR檢測，反應(yīng)條件為：94℃3 min，94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)，分別得到18S及TM4SF1的SQ值及SQ Std.。

1.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染HUVECs轉(zhuǎn)染方法參照Hiperfect說明書，轉(zhuǎn)染前24 h將培養(yǎng)密度約70%～80% HUVECs傳代，接種于兩個10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度約為50%～60%，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，分別加入Hiperfect及兩種siRNA(siControl/siTM4SF1)的混合液，選取兩個轉(zhuǎn)染時間，分別是轉(zhuǎn)染后孵育48 h與72 h，應(yīng)用上述qRT-PCR方法進行轉(zhuǎn)染效果比較。選擇TM4SF1沉默效果理想的時間點進行后續(xù)實驗。

1.2.4 體外HUVECs管腔形成實驗將In Vitro Angiogenesis Assay Kit中的ECMatrixTM與Diluent Buffer置于4℃過夜，進行融化；預(yù)冷Eppendorf管、Tip頭、96孔培養(yǎng)板，以下操作在冰上進行，將100μl的10×Diluent Buffer與900μl的ECMatrixTM加入預(yù)冷的Eppendorf管內(nèi)，輕輕混勻，避免氣泡的產(chǎn)生，取混合液加入預(yù)冷的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔50μl，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至少1 h，讓混合液形成膠狀，胰酶消化已瞬時轉(zhuǎn)染siControl/siTM4SF1的HUVECs，每孔接種10 000個細(xì)胞，加入100μl 0.5%FBS的培養(yǎng)液，在37℃進行培養(yǎng)6 h后顯微鏡下拍照進行比較，根據(jù)In Vitro Angiogenesis Assay Kit的說明書對管腔形成情況進行分級(如表1)。上述實驗重復(fù)3次。

表1 管腔形成的分級

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計學(xué)方法選用Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用I-cycler Real Time PCR儀進行qRT-PCR，分別得到18S及TM4SF1的SQ值及SQ Std.，通過以下?lián)Q算得到比值(RQ)及RQ Std.，其中T為TM4SF1樣品，18為18S樣品，表達量以RQ±RQStd.表示。

2 結(jié)果

2.1 TM4SF1在HUVECs中的表達本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn)TM4SF1在胰腺癌細(xì)胞株MPanc96中高表達，所以本研究采用此細(xì)胞株作為對照，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，MPanc96細(xì)胞中TM4SF1表達量RQ值為(0.56±0.13)，HUVECs中TM4SF1的表達量RQ值為(0.71±0.11)，應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗，P＞0.05，兩種細(xì)胞中TM4SF1表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

2.2 HUVECs瞬時轉(zhuǎn)染后TM4SF1沉默效果的驗證分別選取應(yīng)用siTM4SF1與siControl瞬時轉(zhuǎn)染48 h與72 h的HUVECs，應(yīng)用qRT-PCR檢測mRNA的表達量(圖2)，轉(zhuǎn)染48 h后，siTM4SF1表達量與對照siControl相比下降47.06%；轉(zhuǎn)染72 h后，表達量與對照組相比下降93.14%。2個時間點TM4SF1的表達量均下降，但瞬時轉(zhuǎn)染72 h后的沉默效果更佳。

圖1 HUVECs與MPanc96細(xì)胞應(yīng)用qRT-PCR檢測TM4SF1表達RQ值的比較

2.3 TM4SF1對HUVECs體外管狀結(jié)構(gòu)形成的影響選擇瞬時轉(zhuǎn)染72 h后的HUVECs應(yīng)用In Vitro Angiogenesis Assay Kit進行體外管腔實驗，經(jīng)6 h的孵育，管腔形成情況如圖3所示。通過對管腔形成情況進行評級，siControl轉(zhuǎn)染后HUVECs管腔形成情況為5級，siTM4SF1轉(zhuǎn)染后HUVECs管腔形成情況為2級，沉默TM4SF1后可以明顯抑制HUVECs的體外管腔形成。

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs 48 h及72 h后TM4SF1的表達

圖3 siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs后體外管腔形成檢測(×200)

3 討論

TM4SF1(L6，L6-Ag)的大小約21 kD，是由202個氨基酸組成的小分子膜蛋白，它是四次跨膜蛋白L6超家族成員，此家族還包括TM4SF4、TM4SF5、TM4SF18三個成員[4]。TM4SF1首次被發(fā)現(xiàn)是作為肺癌免疫治療中的一種抗原[5]，Hellstrom等檢測10 000種單克隆抗體雜交肺癌小鼠的脾臟組織，發(fā)現(xiàn)其中14種為肺癌特異性抗體，TM4SF1便是其中的一種，因此當(dāng)時將這種抗原命名為L6，同時發(fā)現(xiàn)L6在乳腺癌及結(jié)腸癌中也有異常表達。此后在一些上皮來源的腫瘤中也發(fā)現(xiàn)有TM4SF1的異常高表達，如卵巢癌、腎癌、前列腺癌等[6-8]，并且發(fā)現(xiàn)其高表達與肺癌、前列腺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲相關(guān)[9-11]。

血管的生成與許多病理生理因素相關(guān)，是嚴(yán)格受機體各種機制調(diào)節(jié)的[12]。腫瘤的血管生成對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，它是腫瘤代謝的關(guān)鍵途徑，腫瘤的血管形成與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲以及腫瘤的預(yù)后等均密切相關(guān)[13]。TM4SF1在許多上皮來源腫瘤中都發(fā)現(xiàn)高表達并與腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲相關(guān)，它是否與腫瘤血管形成相關(guān)呢？在本研究為了觀察TM4SF1基因在血管形成中的作用，應(yīng)用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進行體外研究。通過應(yīng)用qRT-PCR方法檢測TM4SF1在HUVECs中的表達情況，并應(yīng)用siRNA方法沉默HUVECs中TM4SF1的表達后進行體外管腔形成實驗，從而初步探討TM4SF1是否與腫瘤血管形成相關(guān)。

本研究首先應(yīng)用qRT-PCR方法檢測出HUVECs中TM4SF1高表達，再應(yīng)用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染沉默技術(shù)，經(jīng)過瞬時轉(zhuǎn)染72 h后，90%以上的mRNA表達得到抑制，進一步進行體外管腔形成實驗，發(fā)現(xiàn)沉默TM4SF1后HUVECs體外管腔形成情況較對照明顯受抑制，證明抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的TM4SF1可以抑制血管形成，因此，我們推測TM4SF1在腫瘤血管形成中起著重要的作用。在今后的實驗中，可以建立鼠源性RNAi模型，通過在動物體內(nèi)實驗來進一步驗證，并且TM4SF1所參與的信號通路尚需要更進一步的實驗進行研究。

[1]Folkman J,Merler E,Abernathy C,et al.Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis[J].J Exp Med,1971,133(2):275-288.

[2]Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.

[3]Kerbel R,Folkman J.Clinical translation of angiogenesis inhibitors [J].Nat Rev Cancer,2002,2(10):727-739.

[4]Wright MD,Ni J,Rudy GB.The L6 membrane proteins—a new four-transmembrane superfamily[J].Protein Sci,2000,9(8): 1594-1600.

[5]Hellstr?m I,Horn D,Linsley P,et al.Monoclonal mouse antibodies raised against human lung carcinoma[J].Cancer Res,1986,46(8): 3917-3923.

[6]Hellstr?m I,Beaumier PL,Hellstr?m KE.Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas[J]. Proc NatlAcad Sci USA,1986,83(18):7059-7063.

[7]Svensson HP,Frank IS,Berry KK,et al.Therapeutic effects of monoclonal antibody-beta-lactamase conjugates in combination with a nitrogen mustard anticancer prodrug in models of human renal cell carcinoma[J].J Med Chem,1998,41(9):1507-1512.

[8]O'Donnell RT,DeNardo SJ,Shi XB,et al.L6 monoclonal antibody binds prostate cancer[J].Prostate,1998,37(2):91-97.

[9]Kao YR,Shih JY,Wen WC,et al.Tumor-associated antigen L6 and the invasion of human lung cancer cells[J].Clin Cancer Res,2003, 9(7):2807-2816.

[10]Gordon GJ,Dong L,Yeap BY,et al.Four-gene expression ratio test for survival in patients undergoing surgery for mesothelioma[J].J Natl Cancer Inst,2009,101:678-686.

[11]Allioli N,Vincent S,Vlaeminck-Guillem V,et al.TM4SF1,a novel primary androgen receptor target gene over-expressed in human prostate cancer and involved in cell migration[J].Prostate,2011,71 (11):1239-1250.

[12]Folkman J,Shing Y.Angiogenesis[J].J Biol Chem.1992,267(16): 10931-10934.

[13]Welti J,Loges S,Dimmeler S,et al.Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer[J].J Clin Invest,2013,123(8):3190-3200.

Effect of TM4SF1 on capillary-like tube formation in human umbilical vein endothelial cells.

CAO Jia1,HE Si-jia1,XU Lei-ming1,LI Zhao-shen2.1.Digestive Endoscopic Diagnosis and Treatment Center,Xinhua Hospital, School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200092,CHINA;2.Department of Gastroenterology, Changhai Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai 200433,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of TM4SF1 on capillary-like tube formation in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)in vitro.MethodsThe mRNA expression of TM4SF1 in HUVECs was detected by quantitative reverse transcription-PCR(qRT-PCR).HUVECs were transiently transfected with siRNA,and the silence of TM4SF1 was determined by qRT-PCR at 48 h or 72 h after transfection to confirm the time of the best silencing effect.The capillary-like tube formation was detected by In Vitro Angiogenesis Assay Kit and compared between siControl and siTM4SF1.ResultsTheResultsof qRT-PCR showed the expression of TM4SF1 in HUVECs and in MPanc96,a pancreatic cancer cell line,as well.There were no significant difference in RQ values between HUVECs and MPanc96 by Mann-Whitney U test[(0.71±0.11)vs(0.56±0.13),P＞0.05].The expressions of TM4SF1 in HUVECs decreased by 47.06%and 93.14%at 48 h and 72 h after transiently transfection.The capillary-like tube formation was detected in HUVECs at 72 h after transiently transfection by In Vitro Angiogenesis Assay Kit,and scored for the degree subsequently.The tube formation of HUVECs transfected by siControl was grade 5(Closed polygons begin to form,and complex mesh like structures develop),while it was grade 2 when it was transfected by siTM4SF1(Some cells formed angles but no sprouting).ConclusionTM4SF1 was highly expressed in HUVECs.The capillary-like tube formation of HUVECs significantly decreased after silencing of TM4SF1 in vitro.This study indicated that TM4SF1 might be involved in angiogenesis in cancer.

TM4SF1;HUVECs;Tube formation

R329.2+7

A

1003—6350（2014）13—1880—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.13.0731

2014-01-16)