呂春燕，陳高莉，楊 玲，陳昌金，袁 慧，楊雪梅

(1.成都市第五人民醫(yī)院病理科，四川 成都 611130；

2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072；3.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中心實驗室，四川 成都 610072)

大鼠脂肪干細胞分離培養(yǎng)及細胞表型的研究

呂春燕1，陳高莉2，楊 玲2，陳昌金3，袁 慧3，楊雪梅3

(1.成都市第五人民醫(yī)院病理科，四川 成都 611130；

2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072；3.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中心實驗室，四川 成都 610072)

目的分離、培養(yǎng)和凍存大鼠脂肪干細胞，并對其相關的細胞表型進行研究，為利用脂肪干細胞治療梗阻性腎病腎纖維化等實驗提供依據。方法取大鼠3只，經消毒麻醉，采集其腹股溝處脂肪組織分離培養(yǎng)其中的脂肪干細胞，用相差倒置顯微鏡觀察細胞生長方式及形態(tài)變化。取第三代細胞用流式細胞儀作細胞免疫表型的鑒定。凍存復蘇后再次檢測干細胞生長情況及表型。結果大鼠脂肪組織中含有大量間充質干細胞，原代培養(yǎng)的ASCs呈小圓形或星形，經傳代后的脂肪干細胞形態(tài)比較均一，呈長梭形，個別略呈多角形、漩渦樣生長。其細胞表型為CD29、CD44高表達，CD73、CD105中等程度表達，CD34極低表達。脂肪干細胞經低溫凍存3個月，復蘇后，生長活力和存活率與凍存前未見明顯區(qū)別，CD44和CD29檢測與凍存前表達率也一致。結論建立了一種脂肪干細胞的有效分離、培養(yǎng)及保存方法，并對其表面標志物進行鑒定，為利用脂肪干細胞進行進一步的實驗研究提供了依據。

脂肪干細胞；細胞培養(yǎng)；表面標志物；鑒定；凍存

脂肪干細胞(Adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)[1]，具有來源豐富、創(chuàng)傷小、易獲取、增殖快，可以塑形及免疫原性低等優(yōu)點，受到越來越多的重視，因此，脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及保存逐漸成為一項重要技術。本文對大鼠ADMSCs進行分離培養(yǎng)，并對其表面標志物進行檢測及凍存復蘇前后標志物的變化進行研究，為今后進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 清潔級近交系SD雄性大鼠3只，4周齡，體重100～150 g。由四川大學華西醫(yī)學實驗動物中心提供。主要的試劑見表1。儀器有相差倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；熒光顯微鏡(Bio-Rad公司，美國)；流式細胞分析儀(Thermo公司，美國)。

表1 實驗使用的主要試劑情況表

1.2 ADMSCs的分離與培養(yǎng) 取SD大鼠，25%烏拉坦(0.25 g/kg)腹腔麻醉后頸椎脫臼法處死，置于75%的乙醇中浸泡10 min；無菌條件下取出腹股溝皮下脂肪，PBS沖洗3次后，用眼科剪剪碎；加入2～3倍體積的1 g/LⅠ型膠原酶，用移液管移至試管中，置于37℃恒溫箱中30 min，每隔5～10 min振蕩1次；30 min后，加入等量含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，常溫下以離心加速度800 g離心5 min；將上清液輕輕吸出，將細胞沉淀用DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)重懸并稀釋至5倍，用70 μm濾網過濾，以便除去其中未消化的組織。細胞計數板計數，調整細胞濃度為1×105個/ml。在10 cm×10 cm的培養(yǎng)皿中接種，將培養(yǎng)皿培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。第一次換液在24～48 h進行，此后每2～3 d換液，待細胞生長融合達80%～90%時(5～7 d)，進行消化傳代(消化溶液為0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶按2:1混合而成)。用相差倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.3 流式細胞儀檢測 收集第4代細胞，用PBS液洗滌脂肪干細胞3次后，分成6組。每組細胞濃度為2×106個/ml。分別加入相應飽和濃度的單克隆抗體。以加入相應體積的PBS液作為空白對照組。具體見表2。用流式細胞儀作細胞表型的檢測。

表2 流式細胞儀檢測相應單克隆抗體

1.4 ADMSCs的凍存與復蘇 第三代脂肪干細胞經消化后，放入離心機中，以1 000 r/min離心5 min，輕輕吸出上清液。加入按含DMSO：胎牛血清：基礎培養(yǎng)液=1:3:6配制的凍存液，以1×105/ml左右調整細胞密度，并以凍存管保存。然后以下列順序進行保存：4℃冰箱1 h→-20℃冰箱1 h→-80℃冰箱過夜→液氮罐中保存。3個月后，取凍存的第3代ASCs，常溫快速融化，將其復蘇。以離心管裝細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，輕輕吸出上清液。再以15 ml培養(yǎng)液吹打重懸細胞沉淀，再以上述方式離心并吸出上清液。加適當培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察復蘇后細胞的形態(tài)及生長情況，并進行存活率測定(即用0.4%臺盼藍染液測定細胞拒染百分比)。CD44、CD29表達情況的檢測如前述。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 初次接種細胞時，培養(yǎng)物中?？梢娚倭考t細胞，但這些紅細胞數量隨著培養(yǎng)時間的延長和換液次數的增多而逐漸清除。原代培養(yǎng)約24 h，少量細胞開始貼壁，并伸展，多數貼壁細胞形態(tài)不規(guī)則，呈小圓形或小多角形。有細小的突起伸出，核居中，可有1～2個核仁。48 h后可見較多貼壁細胞，未貼壁細胞經換液除去后，可見大部分貼壁細胞呈長梭形，較為扁平，仍可見個別折光率較高的小圓形或卵圓形細胞(圖1)；5～7 d后，融合細胞呈單層排列，可覆蓋85%以上，并向著一定方向生長，但其中仍混有個別卵圓形及圓形細胞(圖2)。消化傳代后，細胞生長速度較原代明顯增快，2～3 d即可覆蓋約85%以上(傳代后細胞形態(tài)見圖3)。

圖1 接種后48 h，脂肪干細胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×10）；圖2接種6 d后，脂肪干細胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×20）；圖3消化傳代后細胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×40）

2.2 流式細胞儀檢測結果 CD44、CD29呈高表達(圖4、圖5)，CD105、CD73中等程度表達(圖6、圖7)，CD34呈極低表達(圖8)。

2.3 脂肪干細胞的凍存與復蘇 經上述方法凍存復蘇后的第3代脂肪干細胞細胞細胞形態(tài)和生長狀態(tài)良好(圖9)，與凍存前無明顯區(qū)別。0.4%臺盼藍染液測定細胞拒染百分比(即存活率測定)為80%。CD44陽性率為95.8%，與凍存前流式細胞儀結果對比如表3，統(tǒng)計學處理顯示，差異有統(tǒng)計學意義。CD29陽性率為99.5%，與凍存前流式細胞儀檢測結果比較見表4，統(tǒng)計學處理顯示，差異有統(tǒng)計學意義。培養(yǎng)3 d后傳代，其增殖能力與凍存前相比，無明顯改變。實驗結果采用兩樣本率等效χ2檢驗，實驗結果經SPSS18.0處理，χ2=54.913，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，可認為凍存前檢測結果與凍存后檢驗結果等效，即一致。實驗結果采用兩樣本率等效χ2檢驗，實驗結果經SPSS18.0處理，χ2=11.577，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，可認為凍存前檢測結果與凍存后檢驗結果等效，即一致。

CD29表達率為99.3% CD44陽性表達率為94.5% CD105陽性表達率為73% CD73陽性表達率為74.7% CD34陽性表達率為1.1%

圖9 經凍存復蘇后細胞生長狀態(tài)良好，3 d后即可傳代

表3 凍存前后CD44表達情況對比表

表4 凍存前后CD29表達情況對比表

3 討論

目前，移植具有良好功能的細胞的細胞移植是治療終末期器官功能損害的研究熱點之一。具有可向多個胚層細胞分化的潛能及良好的自身復制功能的干細胞，已逐漸稱為細胞移植最理想的種子細胞[1-3]。

自從2001年Zuk等[4]首次通過吸脂術抽取脂肪組織懸液培養(yǎng)出多能干細胞，ADSCs因其取材方便，對供體創(chuàng)傷小，一次取材獲取的細胞數量大，免疫原性低等優(yōu)點成為近年來干細胞的研究熱點[5-6]。本實驗對脂肪干細胞進行分離、培養(yǎng)和保存，并對其凍存前后的細胞標識進行研究，為今后的研究提供研究基礎。

目前的研究發(fā)現[7-11]，脂肪干細胞主要表面標志有：CD29(+)、CD44(+)、CD59(+)、CD105(+)、CD166(+)、CD14(-)、CD34(-)、CD38(-)、CD45(-)、CD117(-)等，我們的研究也作了一定探討，研究結果顯示：CD44、CD29高表達，CD105、CD73中等程度表達與文獻報道一致，說明脂肪干細胞分離培養(yǎng)成功。本實驗選取大鼠腹股溝脂肪組織，從中分離出干細胞，由于脂肪組織中含有結締組織及血管組織，內皮標記CD34陽性表達率為0.6%，可能提示細胞成分不純，但極低表達，可根據后續(xù)試驗需要進行處理，必要時再次純化，以得到較多所需細胞。

本實驗初次接種細胞時，有少量紅細胞混在正常培養(yǎng)細胞中，由于紅細胞具有不貼附于塑料培養(yǎng)皿生長的特性，2～3次換液后，隨著培養(yǎng)時間的延長，紅細胞基本被清除，不需要特殊處理，即可獲得較好的效果，減少了雜質的帶入，與文獻報道一致[12]。

本實驗對初次分離培養(yǎng)的脂肪干細胞和凍存3個月后復蘇的脂肪干細胞進行了對比研究，結果顯示第3代脂肪干細胞凍存3個月后復蘇，復蘇前后的細胞形態(tài)和生長狀態(tài)無明顯改變。存活率測定(0.4%臺盼藍染液測定細胞拒染百分比)結果為80%。CD44流式細胞儀檢測陽性率95.8%，而凍存前流式細胞儀檢測陽性率為94.5%，實驗結果采用兩樣本率等效χ2檢驗，實驗結果經SPSS18.0處理，χ2=54.913，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，可認為凍存前檢測結果與凍存后檢驗結果一致，即凍存前后CD44陽性表達率無差別。CD29流式細胞儀檢測陽性率為99.5%，而凍存前流式細胞儀檢測陽性率為99.3%。實驗結果采用兩樣本率等效χ2檢驗，實驗結果經SPSS18.0處理，χ2=11.577，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義，可認為凍存前檢測結果與凍存后檢驗結果一致，即凍存前后CD29陽性表達率無差別。培養(yǎng)3 d后傳代，其增殖能力與凍存前相比，無明顯改變?？傊涍m當凍存的脂肪干細胞生長能力、增殖能力與凍存前一致，這與文獻研究一致[12-14]。CD44、CD29表面標識表達陽性率也無差別。因此，經適當凍存的脂肪干細胞可以用于進一步的實驗研究。

總之，本實驗證實在大鼠腹股溝脂肪組織中含有大量可為細胞移植所用的種子細胞，確立一種經濟簡便的實驗室分離培養(yǎng)及保存ADMSCs的方法，為以后ADMSCs的大量擴增及進一步研究奠定了實驗基礎。

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Isolation,cultivation,identify and cryopreservation of mesenchymal stem cells from rat adipose tissue in vitro.

LV Chun-yan1,CHEN Gao-li2,YANG Ling2,CHEN Chang-jin3,YUAN Hui3,YANG Xue-mei3.
1.Department of Pathology,the Fifth People's Hospital of Chengdu,Chengdu 611130,Sichuan,CHINA;2.Department of Laboratory, Affiliated Hospital to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072,Sichuan,CHINA;3.Central Laboratory,Affiliated Hospital to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo search a method for isolation,cultivation,identification and cryopreservation of mesenchymal stem cells from rat adipose tissue in vitro.Method Three rats was anaesthetized and disinfected conventionally,their inguinal adipose tissue were taken and sheared to paste.The fragments were digested by collagenase typeⅠ,suspended by DMEM,and planted in culture dish.Then the cells were cultured in incubator culture.Their first medium change happen after 24～48 hours，then the change occur 2～3 days once again，after 5～7 days and 80%cell fusion,cells were digested by Trypsin and passaged by EDTA.Cell microscopy was used to morphological observation and the third generation was used to identify by flow cytometric cell cycle.ResultsRats fat had a large amount of adipose-derived mesenchymal stem cells(ADMSCs).The shape of primary culturedASCs was a star or much horn;after passage of the ASCs relatively uniform shape，fusiform shape，spiral growth.The ASCs surface markers are identified by flow cytometry and showed positive expression of CD44,CD106.Cryopreserved ASCs remains a good activity, high survival rate.Conclusion A simple and convenient method was successfully established to isolate,culture and store the adipose tissue derived mesenchymal stem cells,which provides the foundation for the future use of ADMSCs in the further research.

Adipose-derived stem cells;Cell culture;Surface marker;Identification;Cryopreservation

R-332

A

1003—6350（2014）09—1256—04

2013-11-13)