摘要：通過比較多形漢遜酵母基因組及其線粒體基因組的提取方法，獲得一種簡(jiǎn)便、快速、高效、合適、成本低的提取方法。本文以多形漢遜酵母為研究對(duì)象，分別采用試劑盒法、酶解法和LiOAC/SDS/玻璃珠組合法提取多形漢遜酵母基因組及其線粒體基因組DNA，進(jìn)而運(yùn)用核酸凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及其純度。結(jié)果表明：LiOAC/SDS/玻璃珠組合法具有DNA提取量大、成本低、濃度高；試劑盒法提取DNA純度較高、質(zhì)量較好，但是存在提取量小，濃度較低，成本較高等缺點(diǎn)；酶解法濃度一般，純度差，成本高等缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：酵母 線粒體基因組 純度

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）10-0089-03

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序成本的下降，人們已逐步深入到組學(xué)的研究水平。其中，由于酵母菌是一類單細(xì)胞真核微生物，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速、遺傳背景清晰，而且易于接受外源基因，被廣泛作為模式生物或細(xì)胞工廠，應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中。這就需要對(duì)酵母菌進(jìn)行基因組DNA分離提取，而基因組DNA的質(zhì)量是影響高通量測(cè)序或分析細(xì)胞工廠的重要因素。但是，酵母菌的細(xì)胞壁比較厚實(shí)，重量約占其干重的30%，結(jié)構(gòu)比較堅(jiān)韌。細(xì)胞壁主要由三層構(gòu)成，外層以α-1，6糖苷鍵為骨架和相關(guān)支鏈結(jié)合而成的甘露聚糖，內(nèi)層以β-1，6糖苷鍵和相關(guān)支鏈結(jié)合成的葡聚糖，中間層為豐富的蛋白質(zhì)分子。如何有效地破壞堅(jiān)韌厚實(shí)的細(xì)胞壁是高效提取基因組DNA的重要前提，因而選擇一種快速、高效、便捷、經(jīng)濟(jì)的提取方法尤為重要。

已有文獻(xiàn)報(bào)道了液氮研磨法[1]、超聲法[2]、復(fù)合酶法[3]、高壓勻漿法[4]等酵母基因組提取方法。上述方法均存在一定的缺點(diǎn)，其中液氮研磨法需要反復(fù)凍融，操作過程較復(fù)雜，致使基因組DNA損失較多；超聲法對(duì)細(xì)胞壁的破壁效果較差，基因組DNA得率較低；酶解法和高壓勻漿法存在成本高，一次提取量較少，不適宜大量基因組DNA的提取。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)試劑盒法、酶解法、自行設(shè)計(jì)的LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠法進(jìn)行比較，獲得一種簡(jiǎn)便、成本低、高效的基因組和線粒體基因組DNA的提取方法，為其相關(guān)組學(xué)研究提供前提條件。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

多形漢遜酵母（H.polymorpha）DL-1菌株（ATCC No.26012）；

YPD固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20g；蛋白胨20g；酵母膏10g；瓊脂粉15g，pH6.5，121℃滅菌20min；

種子液培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20g；蛋白胨20g；酵母膏10g，pH6.5，121℃滅菌20min；

發(fā)酵液培養(yǎng)基（g/L）：丙三醇15g，（NH4）2SO4 15g，K2HPO4 0.24g，MgSO4·7H2O1.8g，CaCl2 0.28g，NaCl 0.6g，NaNo3 0.58g，F(xiàn)eCl3SO4·6H2O 0.006g，硫胺素鹽酸鹽0.004g，微量元素母液1ml。

微量元素母液（mg/L）：Na2MoO4·2H2O 484mg，MnSO4·H2O 176mg，KI 207.5mg，CuSO4·5H2O 40mg，ZnSO4·7H2O 40mg，pH為6.5。

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉、醋酸鋰、葡萄糖、氯化鈉、氯仿、乙醇等分析試劑購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖、Tris-Hcl、十二烷基硫酸鈉（SDS）、EDTA 、DNeasy Plant Mini Kit、Tris飽和酚等試劑購自美國(guó)Sigma公司。

臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）、漩渦混合儀（美國(guó)LABNET）、Bio-Rad SmartspecTMplus分光光度計(jì)、Bio-Rad DNA電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Alpha-2200），超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母基因組的提取

（1）改良DNeasy Plant Mini Kit試劑盒法。取酵母懸浮液1.5mL，8000r/min離心10min，棄去上清液后，加入100μL酸洗玻璃珠（直徑0.5mm）和100uL細(xì)胞裂解液混勻后，置于漩渦振蕩器上振蕩10min后，離心8000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移到另一EP管中，加入2μL RNaseA和200uL BufferAP1混勻后，放入70℃水浴鍋中孵育20min，期間上下?lián)u勻3-4次后加入65uL Buffer P3混勻。然后放入-20℃冰箱中靜置30min后，4℃條件下12000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至QIA shredder spin柱子中，12，000r/min離心3min。將離心所得液體轉(zhuǎn)移至EP管中，加入1.5倍體積的Buffer AW1，混勻備用。吸取300μl混合液至DNeasy Mini spin柱子中，10000r/min離心1min。將柱子放入新的收集管中，加入250μL Buffer AW2，10000r/min離心1min棄去濾過液。再加入250μL Buffer AW2，14000rpm離心2min。將柱子放入新的EP管中，加入20μL Buffer AE，室溫靜置10min，速度10000rpm離心1min，重復(fù)三次。將沉淀溶解在30μLTE中，-20℃下保存。

（2）LiOAC/SDS/玻璃珠組合法。取1.5mL酵母懸浮液，8000r/min離心10min 收集菌體；用無菌水清洗2次，棄去上清液后加入600μL破壁緩沖液（200mM/L LiOAC/1% SDS）和40μL酸洗玻璃珠（直徑0.5mm），漩渦混合器上振蕩30min，使菌體與破壁緩沖液混合均勻后，再放入70℃水浴鍋中溫育20min后1000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加等體積的預(yù)冷乙醇，充分混勻，14000 r/min離心10min，將沉淀用70%的酒精洗滌兩次后風(fēng)干后，溶于30μLTE緩沖液中，-20℃下保存。

（3）蝸牛酶過夜處理法。取1.5mL菌懸液8000r/min離心10min收集菌體，用無菌水洗滌2次，加入600μL裂解液，35μL蝸牛酶，37℃過夜處理；加入150μL氯仿-異戊醇（v/v24：1），450μL飽和酚，輕輕顛倒2次，混和均勻后靜置10min，3000r/min離心10min；取上清液，用氯仿-異戊醇450μL（v/v24：1）抽提1次，10000r/min離心5min；取上清液加入預(yù)冷乙醇800μL，-20℃靜置30min；14000r/min離心10min，沉淀物用70%乙醇洗兩次，自然干燥后溶于30μLTE緩沖液；加入0.5μLRNaseA（10mg/mL）， 37℃溫浴30min，自然冷卻后-20℃保存。

1.2.2 酵母線粒體基因組的提取

（1）線粒體基因組提取前處理。取在YPD培養(yǎng)液中生長(zhǎng)18h的酵母菌懸液15mL，8000r/min，4℃，離心10min，棄去上清液，加入5mL的GENMED清理液（Reagent A），搖勻。4000r/min，4℃，離心10 min。吸去上清液，向沉淀中加入1mL GENMED平衡液（Reagent B），搖勻。4000r/min，4℃，離心10 min。棄去上清液，再加入0.4mL GENMED平衡液（Reagent B），搖勻，加入10ul GENMED酶解液1（Reagent C），混勻。30℃恒溫水浴鍋內(nèi)孵育60min（每隔15 min輕輕搖勻一次）。加入1mL GENMED平衡液（Reagent B），混勻，3000r/min，4℃，離心10min，重復(fù)兩次。小心吸棄上清液，加入1 mLGENMED裂解液（含有GENMED裂解液（Reagent D）和GENMED凈化液（Reagent E）），渦旋震蕩5s，充分混勻細(xì)胞顆粒群，備用。

（2）線粒體DNA的提取。分別采用試劑盒法、LiOAC/SDS/玻璃珠組合法和酶解法對(duì)上述細(xì)胞顆粒群進(jìn)行破壁處理，在處理過程中，破膜時(shí)間均為酵母菌破壁時(shí)間的1/2，其余操作方法不變。分離純化獲得DNA。

1.2.3 三種方法提取酵母基因組以及線粒體基因組的提取效果比較

用分光光度計(jì)和凝膠電泳儀進(jìn)行測(cè)量比較。電泳條件：1%瓊脂糖凝膠，每加樣孔上樣量都是3μL，100V恒壓電泳30min，然后用Bio-Rad凝膠成像儀成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 分光光度計(jì)法對(duì)酵母基因組的濃度與純度檢測(cè)

利用分光光度計(jì)對(duì)上述方法提取的酵母基因組濃度和純度進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示：試劑盒法提取的酵母基因組的濃度低、純度高，但提取量小、成本高，對(duì)DNA純度要求特別高的試驗(yàn)我們可以采取此方法；LiOAC/SDS/玻璃珠法的濃度最高、純度較高、提取量大、成本低，對(duì)用量大，純度要求不高的可以采用此方法；酶解法的濃度一般、純度差、操作復(fù)雜、成本高，一般與其他方法結(jié)合使用。試劑盒法和酶解法中影響提取的結(jié)果主要原因是，試劑盒法對(duì)酵母細(xì)胞壁破壁不充分，除去蛋白質(zhì)和金屬離子過程中對(duì)DNA損失較大；酶解法對(duì)酵母細(xì)胞壁的破壞效果較徹底，導(dǎo)致碎片在沉淀過程中與DNA、蛋白質(zhì)大量聚合，在洗脫過程中不易洗脫，損失較多，且殘留了大量蛋白質(zhì)。

2.2 分光光度計(jì)法對(duì)線粒體DNA濃度與純度的檢測(cè)

利用分光光度計(jì)對(duì)線粒體DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，試劑盒法提取的DNA純度高、濃度低；LiOAC/SDS/玻璃珠組合法獲得的DNA純度較高，濃度也特別高；酶解法提取的DNA純度低，濃度一般。原因：試劑盒法主要由于在破壁過程中，破壁不充分，基因組不能夠完全釋放；酶解法主要原因是由于酵母細(xì)胞壁碎片、蛋白質(zhì)等與DNA一起聚沉，以及酶處理過程中DNA酶對(duì)DNA的降解；LiOAC/SDS/玻璃珠組合法對(duì)細(xì)胞壁破壁較徹底，DNA提取較完全。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳法[5]

通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)各種方法提取的酵母基因組DNA（gDNA）及其線粒體DNA（mtDNA）濃度進(jìn)行再次驗(yàn)證，結(jié)果如圖3和圖4所示，酵母基因組DNA提取結(jié)果：試劑盒法提取的基因組DNA純度高（無拖尾），濃度低（亮度暗），如圖3泳道1-2所示；酶解法提取的酵母gDNA純度低（有拖尾），濃度低（亮度較暗）（圖3泳道3-4）；LiOAC/SDS/玻璃珠組合法提取的gDNA純度較高，濃度高（亮度最亮），（圖3泳道5-6）。酵母mtDNA提取結(jié)果：酶解法提取的mtDNA純度低（前后均有拖尾），濃度一般（亮度一般）（圖4泳道1）；試劑盒法提取的mtDNA純度高，濃度低（亮度暗），（圖4泳道2）；LiOAC/SDS/玻璃珠組合法提取的mtDNA純度較高，濃度高（亮度最亮），（圖4泳道3）。驗(yàn)證結(jié)果與分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果一致。

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)試劑盒法、LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠組合法、蝸牛酶法提取酵母菌基因組及其線粒體基因組的操作過程以及提取物濃度、純度進(jìn)行綜合比較。認(rèn)為，傳統(tǒng)試劑盒法對(duì)酵母細(xì)胞破壁，其操作過程比較繁瑣，每次提取量較少濃度較低而且價(jià)格比較昂貴，不適合大批量提?。晃伵Ｃ附夥ㄆ票?，一般要求過夜處理，耗時(shí)過長(zhǎng)，又由于蝸牛酶是復(fù)合酶，受環(huán)境影響較大，效率不穩(wěn)定，消化能力較差，導(dǎo)致DNA雜質(zhì)較多，分離純化難度較大，最終獲得DNA純度較低，穩(wěn)定性較差，不利于長(zhǎng)期保存，而且試驗(yàn)成本也比較高；本實(shí)驗(yàn)提供的LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠組合法提取的酵母基因組DNA濃度最高，純度較好，操作過程簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快捷、適合大批量提取，等。

通過比較還可以發(fā)現(xiàn)：試劑盒法、LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠組合法、蝸牛酶法對(duì)線粒體DNA的提取效果與對(duì)酵母基因組DNA的提取效果一致，其中試劑盒法純度高、濃度低；LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠組合法純度較高，濃度特高；酶解法純度差，濃度一般）。LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠組合法不僅適用于酵母基因組的提取，而且對(duì)線粒體基因組DNA的提取也同樣具有良好的效果。因此，本實(shí)驗(yàn)提供的LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠組合法提取酵母基因組DNA和線粒體基因組DNA的方法是一種簡(jiǎn)便、快捷、高效、經(jīng)濟(jì)的提取方法。

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