摘要：利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分別水解大豆蛋白，制備具大豆多肽，通過正交優(yōu)化試驗確定堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶協(xié)同水解的最佳水解條件，考察底物濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、PH值與堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶協(xié)同水解大豆蛋白的影響，為更好地利用大豆蛋白奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶 木瓜蛋白酶 協(xié)同水解 大豆蛋白

中圖分類號：R84 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）10-0085-03

1 引言

1.1 研究意義與目的

本實驗以大豆蛋白為酶解底物，選擇工業(yè)用酶—堿性蛋白酶和常用的木瓜蛋白酶進(jìn)行深度水解，引入正交試驗設(shè)計方法，借助數(shù)學(xué)模型統(tǒng)計分析獲得較高水解度的綜合方案，探討制備小分子大豆肽的最佳工藝，為開發(fā)功能性大豆蛋白，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1.2 技術(shù)路線

實驗技術(shù)路線如下：

豆粕（粉碎）加水調(diào)漿水?。?0℃ 10min）水浴攪拌調(diào)pH

蛋白酶水解滅酶（90℃ 10min）調(diào)酸（pH4.5）離心（4000轉(zhuǎn) 10min）

2 材料與方法

2.1 實驗材料

堿性蛋白酶2.4L：食品級，酶活力2.4AU/g，丹麥NOVO公司出品；木瓜蛋白酶：食品級，酶活力2000U/g，西安Wolsen公司出品；低溫脫脂豆粕：含水量7.9%，蛋白質(zhì)含量51.49%，脂肪含量0.86%，山東萬德福。

2.2 主要儀器和設(shè)備

水浴鍋：DK—98—1型，天津市泰斯特儀器有限公司；pH計：pHSJ—4A，上海精密科學(xué)儀器有限公司；精密增力電動攪拌器：JJ—1，常周國華電器有限公司；自動電位滴定儀：ZDJ-4A，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

2.3 試驗方法

2.3.1 水解條件的研究

（1）大豆蛋白的酶解反應(yīng)。1）大豆蛋白預(yù)處理。豆粕粉碎后加水調(diào)漿制成各濃度大豆蛋白溶液，在90℃溫度下恒溫水浴10min。2）大豆蛋白的酶解操作。稱取豆粕粉加入適量水配制成為一定濃度的大豆蛋白溶液，經(jīng)恒溫水浴預(yù)處理后，調(diào)節(jié)溫度至反應(yīng)溫度攪拌20min，調(diào)節(jié)pH值至反應(yīng)值，加入一定比例蛋白酶，在反應(yīng)溫度下進(jìn)行恒溫酶解，酶解過程中需要不斷進(jìn)行攪拌，同時通過滴加1N的NaOH溶液以保持反應(yīng)體系pH值恒定，反應(yīng)偏差一般控制在±0.1。記錄NaOH溶液的滴加量，利用pH-stat法計算水解度。

（2）酶組合順序的考察。在酶催化水解反應(yīng)中，以pH值、溫度、底物濃度、酶用量對反應(yīng)速度影響較大，而酶用量是針對溶液中蛋白質(zhì)的含量，與底物濃度成正比關(guān)系，因此只需確定適當(dāng)?shù)膒H值、溫度、底物濃度[1]。堿性蛋白酶最佳水解條件：pH8.5，60℃，[S]6%，酶用量6.0，木瓜蛋白酶最佳水解條件：pH6.7，55℃，[S]5%，酶用量0.51[2]。

因此結(jié)合堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶最佳水解條件，建立表2實驗來對酶組合進(jìn)行考察。

2.3.2 最優(yōu)水解條件下產(chǎn)物的制備與測定

（1）水解產(chǎn)物的制備。

將大豆蛋白酶解液加熱升溫至90℃，保溫10min 使酶活力喪失。冷卻至室溫后取酶解液調(diào)節(jié)pH至大豆蛋白等電點（pH4.5）后取一部分酶解液在4°C靜置6-24h，以備觀察其沉淀情況。另一部分通過離心機(jī)在4000r/min，離心10min，制得上清液和沉淀。

（2）水解產(chǎn)物的測定。

1）沉淀的測定。把離心后的部分沉淀（m1）稱量后放入烘干箱（65℃）內(nèi)干燥3h后冷卻至室溫，取出稱重后，再按以上方法進(jìn)行復(fù)烘，每隔30min取出冷卻稱重一次，烘至前后兩次重量差不超過0.005g為止，平行試驗三個。把干燥物取出，稱量離心管（m2）至恒重，記錄數(shù)據(jù)。

2）上清液的測定。測定離心后酶解液的上清液體積（v），倒出上清液測量體積并置于4℃冷藏保存，用凱式定氮法測定蛋白質(zhì)含量。

2.3.3 統(tǒng)計研究方法—正交試驗設(shè)計法

在堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解大豆蛋白時，其水解度會隨著pH值、水解溫度（T）、底物濃度（[S]）等因素的變化會有所不同[2]。確定三因素的取值水平范圍，以水解度（DH）為指標(biāo)，選用三因素三水平實行正交試驗設(shè)計方案進(jìn)行研究。

3 結(jié)果與討論

3.1 堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶協(xié)同水解條件的考察

3.1.1 水解順序的分析

根據(jù)表2做的實驗結(jié)果如表3。

結(jié)合表2和試驗結(jié)果表3可知，實驗組三、四、五的DH要大于實驗組一、二的DH，說明了雙酶水解的水解程度要大于單酶水解的水解程度。DH7>DH5>DH6、DH10>DH8>DH9、DH13>DH11>DH12，說明在同溫同pH同底物濃度下，雙酶同時水解的水解程度要大于雙酶前后水解的水解程度。DH13>DH10>DH7>DH3>DH4，說明在同溫同底物濃度下，不同pH的雙酶同時水解的最小水解程度仍然大于雙酶單獨水解最佳pH情況下進(jìn)行的前后水解的程度。可以得出結(jié)論，雙酶同時作用水解要比雙酶前后作用水解程度大。

3.1.2 正交試驗確定最佳水解條件

結(jié)合酶組合的考慮和各因素間的相互依賴、相互制約，進(jìn)行正交試驗以確定各參數(shù)的最佳組合即酶解大豆蛋白的最佳水解條件。這里用正交表，以水解度（DH%）為測定指標(biāo)，雙酶同時水解，擬定出試驗方案表來考察三個因素對水解的影響，水解時間為5h。因素分析表如表4。

正交試驗表如表5。

由正交試驗結(jié)果表5看出，空列R的值小于其它各因素的的R，可以判定個實驗因素的效應(yīng)R是可靠的。極值R越大，則表示因素的水平變化對實驗的影響越大，在實驗中越重要。在影響堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶協(xié)同水解大豆蛋白的水解度的三個因素中，其影響程度大小為A>C>B，最優(yōu)組合為A3B2C1。在此組合條件下水解5h，測得水解度為36.30%。故確定堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶協(xié)同水解大豆蛋白的最佳水解條件：pH值為8.5，底物質(zhì)量濃度為5.0%，水解溫度為55℃。

3.1.3 最佳水解條件下的水解曲線

由圖1可知，在雙酶協(xié)同水解的最佳水解條件，水解1h，為保持恒定的pH（8.5）而消耗的堿量最大，此后消耗的堿量逐漸減少。在水解6h的延長時間里，蛋白質(zhì)酶解液水解程度隨著時間的延長明顯增加，而在水解的6h后水解速度幾乎不變。在水解時間達(dá)到6.5h時，水解度達(dá)到了36.44%。隨著時間的延長水解度雖呈上升趨勢，但蛋白酶可水解的肽鍵逐漸減少，從經(jīng)濟(jì)方面和水解液苦味的考慮，確定最佳水解時間為5h。

3.2 最佳水解條件下水解產(chǎn)物的分析

沉淀結(jié)果分析：100ml大豆蛋白溶液可制得約10g豆渣。上清液結(jié)果分析：100ml原料蛋白溶液可制的可溶性蛋白質(zhì)約為214.2mg。另在4℃靜置6-24h的酶解液，其沉淀情況很好，可以明顯的看出上清液和沉淀。

4 結(jié)語

（1）將堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶的結(jié)合水解大豆蛋白，水解程度明顯高于單酶水解，雙酶加入順序為堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶同時水解較優(yōu)。（2）雙酶水解大豆蛋白的最佳工藝條件為：pH8.5、溫度55℃、底物濃度為5%、堿性蛋白酶加酶量為0.051%（W/V）、木瓜蛋白酶加酶量為6%（W/V），在反應(yīng)時間為5h的條件下，酶解液中可溶性大豆蛋白含量為3.06mg/ml，水解度為36.30%。（3）各因素對水解度的影響由大到小依次為：pH對水解度的影響最大，其它因素的影響從大到小依次為底物濃度>溫度>時間。

參考文獻(xiàn)

[1]朱秀清，許慧.酶法大豆蛋白水解程度控制研究.糧油食品科技第13卷，2005年第1期.

[2]李大明，宋煥祿.大豆蛋白酶解的研究[J]食品科技，2006，2.