摘要：殼聚糖酶是一類催化氨基葡萄糖間的β-1，4-糖苷鍵斷裂，從而專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶，其催化產(chǎn)物殼寡糖在保健食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊前景。本文介紹了近些年來殼聚糖酶的研究狀況，包括微生物來源、理化性質(zhì)、分類、催化機(jī)理、分子生物學(xué)進(jìn)展和三種制備方法，提出并分析了當(dāng)前研究中存在的問題，最后對今后研究方向作了展望。

關(guān)鍵詞：微生物 殼聚糖酶 殼寡糖 發(fā)酵

中圖分類號：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）10-0002-01

1973年，Monaghan等在研究細(xì)菌和真菌過程中，首次提出殼聚糖酶的概念。1992年殼聚糖酶被系統(tǒng)命名為EC3.2.1.132。2004年，國際酶委員對殼聚糖酶重新定義為：一類催化氨基葡萄糖間的β-1，4-糖苷鍵斷裂，從而專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶，殼聚糖酶的發(fā)現(xiàn)可克服殼聚糖生產(chǎn)成本高和溶解性的缺陷，從而轉(zhuǎn)化為溶解性更優(yōu)越、溶液穩(wěn)定性更強(qiáng)、生物活性更豐富的殼寡糖，這就成了現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)方向。作者結(jié)合近年來國內(nèi)外殼聚糖酶的研究成果，綜合分析了殼聚糖酶的分類、性質(zhì)和制備方法等研究現(xiàn)狀。

1 殼聚糖酶概述

殼聚糖酶目前有3種分類方法[3]：底物專一性差別和酶的產(chǎn)生特點(diǎn)。根據(jù)底物專一性差別，殼聚糖酶可以分為三類，第一類可以水解GlcN-GlcN鍵及GlcNAc-GlcN鍵；第二類只能水解GlcN-GlcN鍵；第三類既可水解GlcN-GlcN鍵，又可水解GlcN-GlcNAc鍵。根據(jù)酶的產(chǎn)生特點(diǎn)，可以將殼聚糖酶分為組成型和誘導(dǎo)型。

殼聚糖酶大部分為堿性蛋白，其最適pH值范圍一般在4.0～8.0。酶的等電點(diǎn)（pI）變化范圍大多集中在4.0～10.1。殼聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度在30～60℃。研究發(fā)現(xiàn)金屬離子尤其是重金屬離子對殼聚糖酶活性有不同程度的影響。大部分殼聚糖酶屬于內(nèi)切酶，降解殼聚糖生成殼二糖、殼三糖等寡聚體的混合物，殼聚糖酶在酶解過程中的活性是隨著N-乙?；?、N-取代基團(tuán)及其不同取代位置以及均相和非均相反應(yīng)體系而變化的。

2 殼聚糖酶的微生物制備方法

2.1 微生物液體發(fā)酵

目前研究公認(rèn)大多數(shù)微生物來源的殼聚糖酶屬于誘導(dǎo)酶，因此當(dāng)以殼聚糖作為唯一碳源時(shí)，微生物的產(chǎn)殼聚糖酶的能力就能被誘導(dǎo)出來。一般的液體發(fā)酵步驟是通過平板分離初篩和搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩，從土壤中篩選出產(chǎn)殼聚糖酶菌株，然后經(jīng)酶活力檢測比較，挑選出產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的菌株作為產(chǎn)酶試驗(yàn)菌。當(dāng)然也可通過人工誘變處理來獲得高產(chǎn)突變株，最常用的方法是化學(xué)法和物理法誘變，可采用單因子誘變處理和復(fù)合因子處理。目前對于殼聚糖酶的分離純化方法主要有（NH4）2SO4分級鹽析、Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換、Sephacry S-100凝膠過濾分離等方法。酶活單位定義為每分鐘催化生成相當(dāng)于1μmol氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。測定殼聚糖酶最常用的方法是DNS法，此外還有粘度法快速測定法和鐵氰化鉀顯色法。對已篩選出的產(chǎn)殼聚糖酶菌種的鑒定一般包括①形態(tài)學(xué)特征鑒定；②生理生化特性鑒定；③16S rDNA序列分析。由于殼聚糖酶的穩(wěn)定性不高、壽命短、且無法循環(huán)使用，在生產(chǎn)中的應(yīng)用受到了極大限制，但是通過固定化后上述缺點(diǎn)都可以解決。

2.2 絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵

工業(yè)上固態(tài)發(fā)酵是生產(chǎn)酶制劑的主要方式，對于菌絲體有利于保持其自然生理狀態(tài)和生長，所用培養(yǎng)基和發(fā)酵條件更加低廉和簡單，而且投資較少；純化步驟少，產(chǎn)品純度高，是絲狀真菌的一種理想培養(yǎng)方法，糖化工業(yè)中以常見的根霉菌絲體替代純殼聚糖為誘導(dǎo)原料。

2.3 基因工程育種

除了在自然界中繼續(xù)篩選產(chǎn)酶活性較高的微生物菌種外，現(xiàn)在越來越多的研究人員利用基因工程通過對產(chǎn)殼聚糖酶菌株的基因分析，運(yùn)用分子方法克隆并高效表達(dá)所選菌種的殼聚糖酶基因，以實(shí)現(xiàn)重組菌的殼聚糖酶高效表達(dá)，具體技術(shù)路線如下：根據(jù)所選菌株殼聚糖酶基因序列或參照其他菌株的殼聚糖酶基因序列→PCR引物設(shè)計(jì)，引物合成→提取所選菌株總DNA→PCR擴(kuò)增獲得目的基因→構(gòu)建原核表達(dá)載體→重組菌高效表達(dá)條件研究→殼聚糖酶高效表達(dá)。

3 研究展望

繼續(xù)篩選產(chǎn)酶活性較高的微生物菌種的過程中，要合理運(yùn)用新的誘變方法或進(jìn)行復(fù)合誘變，以減小菌種對誘變方法的抗性，從而獲得高產(chǎn)菌株。另外，對發(fā)酵條件也要進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，篩選出最佳產(chǎn)酶條件，以獲得最大的產(chǎn)酶量。另一方面，應(yīng)該緊跟國際前沿，進(jìn)一步在分子水平上研究殼聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，以便更有效地克隆細(xì)菌殼聚糖酶基因，構(gòu)建能高效表達(dá)殼聚糖酶的工程菌株，對酶分子進(jìn)行定向修飾，從本質(zhì)上提高殼聚糖酶的活性與穩(wěn)定性，加速其應(yīng)用的大規(guī)模實(shí)用化和產(chǎn)業(yè)化。

參考文獻(xiàn)

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