石見 譚盛 吳培華 陳健

不同水平高血糖對(duì)大鼠局灶腦缺血損傷的影響☆

石見*譚盛*吳培華*陳健*

目的 觀察不同水平高血糖對(duì)大鼠局灶腦缺血的影響。方法將23只成年雄性大鼠隨機(jī)分為正常血糖組（N）6只、高血糖1組（H1）6只、高血糖2組（H2）11只。采用線栓法建立90min局灶腦缺血模型（middle cerebralartery occlusion,MCAO），缺血開始后5m in、50min、95min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過腹腔注射不同劑量50%葡萄糖溶液使其血糖分別維持在10mmol/L（H 1）和20mmol/L（H2）。正常血糖組（N）在相同時(shí)間點(diǎn)注射生理鹽水作為對(duì)照。腦缺血后24 h采用mNSS評(píng)分和rotarod評(píng)估神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度，TTC染色檢測(cè)腦梗死面積。結(jié)果與N組相比，H2組mNSS和rotarod評(píng)分更差，腦梗死面積增加24.26%（P＜0.01）。H1組與N組比較，mNSS、rotarod評(píng)分以及腦梗死面積無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論卒中后嚴(yán)重高血糖（20mmo/L）顯著增大腦梗死面積，加重神經(jīng)功能損傷，而輕度高血糖（10mmol/L）對(duì)腦梗死面積和神經(jīng)功能損傷無(wú)顯著影響。

腦缺血 高血糖 mNSS評(píng)分 rotarod TTC

流行病學(xué)及臨床研究表明，約40%～70%急性缺血性腦卒中患者存在卒中后高血糖[包括潛在的糖耐量減低（underlying impaired glucose tolerance）、未診斷的糖尿?。╱nrecognized diabetesmellitus）和應(yīng)激性高血糖（stresshyperglycemia）][1-2]，且這部分患者較正常血糖者不良事件發(fā)生率、死亡率增加[3-4]。然而嚴(yán)格降糖治療是否能改善急性缺血性腦卒中患者的預(yù)后仍缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)[5]。正確理解卒中后高血糖病生機(jī)制對(duì)更大規(guī)模臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)非常重要。但是在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，動(dòng)物局灶腦缺血后高血糖的研究結(jié)果不盡一致，部分研究表明高血糖增加腦梗死面積，另一部分研究提示輕度高血糖可能有益[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型，腹腔注射不同劑量50%葡萄糖溶液，維持卒中后血糖為輕度高血糖（10 mmol/L）、嚴(yán)重高血糖（20mmol/L），與血糖正常對(duì)照組（5～6mmol/L）對(duì)比觀察24 h后腦梗死面積和神經(jīng)功能缺損情況，為臨床卒中急性期血糖管理提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，SPF級(jí)，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK（粵）2011-0015,體重240～260 g。飼養(yǎng)溫度24℃，相對(duì)濕度40%～70%，明暗周期12 h，正常飲食，自由飲水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及操作均符合廣東省及南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理?xiàng)l例，遵循“3R”原則。隨機(jī)分組：正常血糖組（5mmol/L，N）6只，高血糖1組（10 mmol/L，H1）6只，高血糖2組（20mmol/L，H2）11只（因前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2組造模后約死亡一半，故實(shí)驗(yàn)分組時(shí)，增加H2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量）。

1.2 建立大鼠局灶腦缺血（MCAO）模型 采用改良Zea-Longer插線栓方法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型(MCAO)。具體方法：大鼠術(shù)前禁食15～17 h，不禁水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.2 mL/kg）麻醉后，取大鼠頸部正中縱向切口，切開皮膚，游離右側(cè)頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。離斷頸外動(dòng)脈2個(gè)小分支血管，在距離頸總動(dòng)脈分叉5mm遠(yuǎn)心端用4-0絲線結(jié)扎離斷頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈靠近頸總動(dòng)脈分叉處打一個(gè)活結(jié)備用。用血管夾暫時(shí)夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈起始端。在頸外動(dòng)脈距離分叉4mm處剪一破口，線栓（直徑0.26mm的魚線蘸蠟后灼燒頭端使之膨大，用肝素浸泡）由破口插入頸外動(dòng)脈，結(jié)扎緊預(yù)留的線結(jié)，松開血管夾，沿頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入線栓，待線栓進(jìn)入21～22 mm稍有阻力感，停止插線栓。線栓放置90 min后撤出線栓，結(jié)扎緊預(yù)留線結(jié)?？p皮、消毒。術(shù)中加熱墊保溫，待麻醉蘇醒后自由進(jìn)食飲水，單籠喂養(yǎng)。

1.3 誘導(dǎo)卒中后高血糖（poststroke hyperglycemia）H1組和H2組在缺血后5 min開始接受間隔45min共3次腹腔注射（intraperitoneal injection，IP）50%葡萄糖溶液（如圖1A所示）。H1組和H2組首次注射50%葡萄糖溶液劑量分別為2.5 mL/ kg、8mL/kg，隨后2次均按2mL/kg進(jìn)行腹腔注射，維持缺血后10mmol/L及20mmol/L血糖水平；正常血糖組按2mL/kg共3次注射生理鹽水。缺血開始時(shí)、每次腹腔注射后30min取尾尖血測(cè)定血糖水平。腦缺血后12 h內(nèi)，H2組有5只死亡。

1.4 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分 采用改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分方法(modified Neurological Severity Score,mNSS)在術(shù)后24 h分別對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，包括運(yùn)動(dòng)、感覺、反射等方面。得分越高提示神經(jīng)功能損傷越重：總分14分，10～14分重度受損；5～9分中度受損；1～4分輕度受損。

1.5 轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)（Rotarod）本實(shí)驗(yàn)采用自動(dòng)旋轉(zhuǎn)桿監(jiān)測(cè)儀（Harvard Apparatus，圖3A）來(lái)評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。MCAO前3 d為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，將大鼠置于轉(zhuǎn)桿上，轉(zhuǎn)速在5min內(nèi)從4 rpm升至40 rpm，每天訓(xùn)練5次，每次間隔15min。大鼠在轉(zhuǎn)桿上爬行開始計(jì)時(shí)，大鼠從轉(zhuǎn)桿跌落至腳踏板上，自動(dòng)停止計(jì)時(shí)，記錄下大鼠在轉(zhuǎn)桿上停留的時(shí)間（latency）。在MCAO前1 d，每只動(dòng)物進(jìn)行3次轉(zhuǎn)桿測(cè)試實(shí)驗(yàn)，取3次試驗(yàn)平均值作為基線值。MCAO后24 h，進(jìn)行3次轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)，rotarod運(yùn)動(dòng)測(cè)試數(shù)據(jù)表示為3次實(shí)驗(yàn)平均值與自身對(duì)照基線值的百分比。

1.6TTC染色 MCAO后24 h處死大鼠，斷頭取腦，放入0.1mmol/L PBS的冰水混合物中1min后取出。置入大鼠腦槽中，自額極起間隔2mm連續(xù)冠狀切片，共切腦片6片。將腦片迅速浸泡于2% TTC溶液（Sigma公司，美國(guó)）中，常溫孵育6min，翻轉(zhuǎn)腦片繼續(xù)孵育6min，顯色（正常腦組織呈紅色，梗死部分呈現(xiàn)白色）后4%多聚甲醛固定6 h，拍照記錄，使用圖像分析軟件IPP（Image Pro Plus）進(jìn)行腦梗死面積分析。為矯正缺血后腦水腫，結(jié)果記錄為腦梗死面積百分比（%）=腦梗死面積/缺血對(duì)側(cè)腦面積。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（x±s）表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)（rotarod實(shí)驗(yàn)，和mNSS）使用Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)。組間比較使用單因素方差分析，采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間均值兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

MCAO后間隔45min，共3次腹腔注射50%葡萄糖溶液，使高血糖1組（H1）和高血糖2組（H2）卒中后血糖水平分別維持在10 mmol/L及20 mmol/L左右，正常血糖組（N）腹腔注射生理鹽水，卒中后血糖水平在5～6mmol/L（圖1B）。

2.1 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（mNSS）結(jié)果 正常血糖組（N）、高血糖1組（H1）和高血糖2組（H2）改良的神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（x±s）分別為4.00± 0.89、5.17±1.17和8.83±1.17。高血糖2組（H2）神經(jīng)功能中度受損，與正常血糖組（N）和高血糖1組（H1）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.406，P＜0.01）。高血糖1組（H1）與正常血糖組神經(jīng)功能輕中度受損，兩者對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.184），見圖2。

2.2 轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組rotarod實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為：57.42%±5.35%（正常血糖組）、51.06%±6.71%（高血糖1組）、31.42%±5.65%（高血糖2組）。高血糖2組（H2）腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能缺損程度更嚴(yán)重（F=31.31，P＜0.01），高血糖1組（H1）與正常血糖組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.185），見圖3B。

2.3TTC染色結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常血糖組（N）、高血糖1組（H1）和高血糖2組（H2）腦梗死面積百分比分別為24.93%±5.31%、，30.87%± 3.68%和49.19%±2.02%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí)，高血糖2組（20 mmol/L）腦梗死面積顯著增大（F=52.40，P＜0.01），而高血糖1組（10mmol/L）與正常血糖組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.079），見圖4。

3 討論

大量臨床觀察性研究表明急性缺血性腦卒中伴血糖升高者，死亡率升高、卒中后90 d神經(jīng)功能恢復(fù)差[2]。既往研究認(rèn)為高血糖可能通過多種途徑增大腦梗死面積，從而使患者預(yù)后變差[8-10]。但一項(xiàng)針對(duì)卒中后高血糖采取嚴(yán)格降糖治療的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，葡萄糖-鉀-胰島素（glucose potassium insulin，GKI）靜脈輸注降低血糖水平，但未能減少腦梗死面積[11]。該隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)未能得出顯著性結(jié)果，可能由于未達(dá)到預(yù)先設(shè)計(jì)的樣本量，導(dǎo)致檢驗(yàn)效能下降，但也可能由于納入的非干預(yù)組平均血糖水平僅輕度升高（約7mmol/L）。流行病學(xué)研究指出臨床卒中后高血糖水平主要集中在7～12mmol/L[1]，提示輕度升高的血糖可能并不會(huì)加重缺血缺氧損傷及增大腦梗死面積。本研究輕度高血糖組（10mmol/L，H1）血糖水平很好的符合臨床卒中后高血糖的波動(dòng)范圍，與正常血糖組（5～6mmol/L，N）相比，結(jié)果顯示兩組間腦梗死面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性（rotarod）也無(wú)顯著性差異。雖然既往文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為MCAO模型中高血糖顯著增大腦梗死面積，但多利用鏈脲霉素（streptozotocin，STZ）破壞胰腺β細(xì)胞，產(chǎn)生1型糖尿病，誘導(dǎo)形成高血糖。1型糖尿病患者存在下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）過度激活伴循環(huán)血液中腎上腺皮質(zhì)激素（adrenal glucocorticoids）水平顯著升高，本身HPA軸的過度激活就會(huì)增大腦梗死面積，Martin等[12]也證實(shí)使用腎上腺皮質(zhì)激素抑制劑美替拉酮（metyrapone）可減少皮層梗死面積。我們認(rèn)為本研究的結(jié)果更具有說服力，因?yàn)槲覀冞x取的腹腔注射葡萄糖溶液誘導(dǎo)高血糖的方式不涉及復(fù)雜的病生機(jī)制，能更清楚的闡明高血糖與腦梗死面積的關(guān)系。我們綜述文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)采用直接注射葡萄糖方式誘導(dǎo)高血糖的相關(guān)基礎(chǔ)研究選取的血糖水平超過20mmol/L，并較一致認(rèn)為該水平高血糖使腦梗死面積顯著增大[6]。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重高血糖（20mmol/L）與血糖正常對(duì)照組（5～6mmol/L）對(duì)比，腦梗死面積增加24.26%，同時(shí)局灶腦缺血后神經(jīng)功能缺損程度加重（mNSS評(píng)分和rotarod實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。因此，葡萄糖作為腦組織的最重要的功能物質(zhì)，其水平輕度升高并不會(huì)影響神經(jīng)功能，造成腦梗死面積增大，但當(dāng)其超過一定限度，則加重缺血后腦損傷。然而本研究存在一定的局限性。眾所周知，缺血性腦卒中急性期高血糖可能存在兩種主要情形：①患者既往合并糖尿病或糖耐量異常，缺血性腦損傷致使原有的代謝紊亂惡化；②既往無(wú)糖代謝異常，缺血性腦損傷引起應(yīng)激性血糖升高[13]。針對(duì)這兩種不同情況，一項(xiàng)納入375例缺血性腦卒中患者的臨床研究?jī)H在非糖尿病者中觀察到高血糖與腦梗死面積增大以及神經(jīng)功能惡化的關(guān)系[14]。可見，由于糖尿病涉及的病生機(jī)制更為復(fù)雜，卒中后高血糖對(duì)糖尿病患者的影響不同于非糖尿病者。而本研究采用腦缺血后腹腔注射葡萄糖動(dòng)物模型，更符合卒中后應(yīng)激性高血糖的臨床特征，并不能模擬既往存在糖尿病或糖耐量異常的情況。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖A.腦缺血開始后各個(gè)腹腔注射和血糖測(cè)定時(shí)間點(diǎn)B.三組動(dòng)物血糖測(cè)定結(jié)果

圖2 改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（*與正常血糖組對(duì)比P＜0.01）

圖3 轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)A.自動(dòng)旋轉(zhuǎn)桿監(jiān)測(cè)儀B.不同水平高血糖對(duì)轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響（*與正常血糖組對(duì)比P＜0.01）

圖4 不同水平高血糖對(duì)腦梗死面積影響A.TTC染色結(jié)果B.腦梗死面積定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（*與正常血糖組對(duì)比P＜0.01）

綜上所述，一定程度卒中后高血糖（10mmo/L左右）不會(huì)顯著增大腦梗死面積，加重缺血性腦損傷，而嚴(yán)重高血糖（20mmol/L）顯著增大腦梗死面積并加重神經(jīng)功能缺損程度。本研究為進(jìn)一步臨床干預(yù)性實(shí)驗(yàn)制定卒中后高血糖降糖治療目標(biāo)值提供一定參考。

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A

2013-12-22）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.05.012

☆國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81301098）；廣州市海珠區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2011-YL-06）

*南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州510282）