莊越 金文香

血管生成素1對腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用及其機(jī)制

莊越*金文香△

目的 觀察血管生成素1對沙土鼠全腦缺血再灌注損傷后腦血流S-100β蛋白表達(dá)的影響，以及對腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor-）和IL-1、(interleukin-1)的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法健康成年沙土鼠45只，隨機(jī)分3組（每組n=15只）：假手術(shù)組（sham operation group,S組）；缺血再灌注組（ischemia-reperfusion group,IR組）；血管生成素1組（angiopoietin-1 group，Ang1組）；于缺血前(T0)、再灌注2 h (T2)、再灌注6 h(T3)、再灌注12 h(T4)、再灌注24 h(T5)各時(shí)間點(diǎn)抽取頸靜脈血測S-100β蛋白含量、TNF-a、IL-1的含量的變化；并于各時(shí)間段監(jiān)測頸靜脈血樣氧飽和度（jugular venous oxygen saturation,SjvO2）。結(jié)果①與S組比較IR組血清TNF-a、IL-1、S-100?蛋白含量顯著增高(0.815±0.080μg/L)（P＜0.05）。Ang1組也較S組升高但幅度低于IR組（P＜0.05）(0.58±0.11μg/L)；②Ang1組的SjvO2明顯高于IR組相對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）(82%±12%)。結(jié)論血管生成素1可能通過減輕腦血管炎癥反應(yīng)過程和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性來減輕腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷從而起到保護(hù)作用。

S-100β蛋白血管生成素-1腫瘤壞死因子-a 白介素1(IL-1)頸靜脈血氧飽和度

血管生成素1(angiopoietin-1，Ang1)于1996年被發(fā)現(xiàn)[1]，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶Tie-2的配體。具有強(qiáng)的促血管生長作用的細(xì)胞因子，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞出芽、遷移、穩(wěn)定血管，在組織修復(fù)及血管發(fā)生方面起一定作用。S-100β蛋白是一種相對分子量為21×103的酸性鈣結(jié)合蛋白，血液中很難檢測到。呈濃度特異性地存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞中，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞受損時(shí)，將釋放大量的S-100β蛋白通過受損的血腦屏障進(jìn)入血液中。因此本研究以S-100β蛋白作為主要觀察指標(biāo)來研究Ang1對全腦缺血再灌注損傷腦保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 健康蒙古沙土鼠60只（由廣州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重50～80 g，雌雄不拘；隨機(jī)分3組：假手術(shù)組（S組，n= 15）；缺血再灌注組（IR組，n=15）；Ang1組（n=15）；余下沙土鼠子作為異常死亡或造模失敗的補(bǔ)充。腦缺血大鼠模型的建立按Longa線栓法[2-3]制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型：腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉，做頸部正中切口1 cm,暴露右頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈分支，在頸外動脈距其始端約2mm處做一小切口，用3.0尼龍線一端烤成小球形，小球端經(jīng)切口處插入頸外動脈，再經(jīng)頸內(nèi)外動脈分叉處插入約2 cm至大腦中動脈，栓塞1 h制備腦缺血模型，縫合切口并留線至外端。拔出絲線即為再灌注開始記時(shí)。同時(shí)分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈并逆行穿刺置入24G，BD留置針管至球部，備抽血采樣及靜脈補(bǔ)液用以防止多次抽血對血壓波動的影響。一側(cè)股動脈穿刺置管連接換能器進(jìn)行血流動力學(xué)監(jiān)測。a、Ang1組再灌注開始腹腔立即注射人重組Ang1劑量為300μg/kg；IR組再灌注開始立即腹腔注射相同體積的生理鹽水；S組只剝離雙側(cè)頸總動脈不栓塞同樣腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.2 神經(jīng)功能缺損體征評分 參照Longa標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分[2]。按上述標(biāo)準(zhǔn)，于再灌注后第24 h記錄各組動物死亡情況，并參照文獻(xiàn)[4-5]:2級(1分)～4級(3分)為入組標(biāo)準(zhǔn)即成功造模。排除標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)沙土鼠在缺血開始后30～60 s內(nèi)未出現(xiàn)①昏迷，翻正反射消失，②能自主呼吸，③雙側(cè)瞳孔放大，痛覺反射消失，神經(jīng)行為學(xué)癥狀的沙土鼠子棄用；以及在缺血期死亡或?qū)嶒?yàn)過程中出現(xiàn)抽搐的沙土鼠均被棄去。

1.3 標(biāo)本的采集與檢測 各組分別于缺血前(T0)、再灌注2 h(T1)、再灌注6 h(T2)、再灌注12 h(T3)、24h（T4）各時(shí)間點(diǎn)抽取頸靜脈球部血1 mL，常溫下3000 r/min離心10min，取上清液置于-70℃冰箱保存待測。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，嚴(yán)格按試TNF-α，IL-1、S-100β蛋白試劑使用步驟測定血清TNF-α，IL-1、S-100β蛋白濃度。

1.4 腦組織氧代謝檢測計(jì)算SjvO2各組分別于各時(shí)點(diǎn)，分別自股動脈和頸靜脈球部抽血測Hct、血?dú)夥治?、乳酸含量。?jì)算動脈-頸內(nèi)靜脈球部血氧含量差（Da-jvO2）根據(jù)Fick原理：SjvO2=SaO2—CMRO2/(CBF×CaO2)，動脈-頸內(nèi)靜脈球部血氧含量差（Da-jvO2）=CMRO2/CBF[3]。

1.5 腦含水量 各組分別取10只大鼠，分別在再灌注2 h和24 h時(shí)用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，迅速斷頭取腦，用濾紙吸干大腦表面水分和血液。取缺血側(cè)大腦半球，用電子天平稱量其濕重。然后將其放入電熱干燥箱中以120℃烘干，直至稱量的兩次重量差小于1%濕重，則最后一次重量為干重，按以下公式計(jì)算腦含水量：(濕重－干重)÷濕重×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件13.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以（±s）表示。組內(nèi)比較兩樣本均數(shù)成正態(tài)分布的比較采用配對t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布用曼惠特尼U檢驗(yàn)；多時(shí)間點(diǎn)比較用重復(fù)測量方差分析；組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1S-100β蛋白 IR組與S組比較在T2、T3、T4時(shí)的血清S-100β蛋白顯著升高（0.815±0.080μg/L）；與T1時(shí)比較隨再灌注時(shí)間延長而增加；Ang1組在T2、T3、T4時(shí)血清S-100β蛋白較S組各觀察時(shí)間點(diǎn)也增高（P＜0.05）；但Ang1組的增幅均明顯低于IR組（P＜0.05），見表1。

2.2 炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1IR組在T2、T3、T4時(shí)的血清TNF-α、IL-1表達(dá)較S組顯著增高（P＜0.01）；組內(nèi)比較也較T0、T1時(shí)顯著增高（P＜0.05）；Ang1組在T2、T3、T4時(shí)血清TNF-α表達(dá)較S組增高；但Ang1組的增幅均明顯低于IR組相對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05），見表2、表3。

2.3SjvO2IR組在T1、T2觀察SjvO2明顯降低（P＜0.01），Ang1組在T1、T2時(shí)SjvO2也降低（P＜0.05）但降低幅度低于IR組（P＜0.05），見表4。

2.4 腦水含量 與S組比較，在T1、T4時(shí)I/R組和Ang1組腦含水量顯著升高(P＜0.05)；在T1、T4時(shí)與I/R組比較，Ang1組腦含水量降低（P＜0.05），見表5。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以沙土鼠作為造模動物，因沙土鼠頸內(nèi)動脈系統(tǒng)和椎動脈系統(tǒng)的腦底動脈環(huán)后交通支先天缺損或發(fā)育不全不能構(gòu)成完整的Willis動脈環(huán)[6]。并以Longa法建立腦缺血模型，因此技術(shù)很成熟，成功率高。參照Longa標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分，并參照文獻(xiàn)[4-5]:2級(1分)～4級(3分)為入組標(biāo)準(zhǔn)即成功造模。

表1 血漿S-100β蛋白濃度(μg/L)

表2 血漿TNF-α濃度(ng/L)

表3 血漿IL-1濃度(ng/L)

表4 SjvO2（%）指標(biāo)

表5 各組缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)腦含水量（%）的比較（±s）

表5 各組缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)腦含水量（%）的比較（±s）

1）與S組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)10）P＜0.05；2）與IR組比較，經(jīng)單因素方差分析11)P＜0.05

組別S組IR組Ang-1組n 10 10 10 T1 76.43±9.26 85.86±8.4810）80.78±2.8410)11)T4 76.47±3.39 88.02±4.0310)82.37±1.2910)11)

本實(shí)驗(yàn)把S-100β蛋白作為判斷血腦屏障損傷即腦缺血再灌注損傷的監(jiān)測指標(biāo),是因?yàn)镾-100β蛋白分子量大，正常情況下很難通過血腦屏障，腦血流中很難檢測到。研究表明[7]腦損傷后20min后即可檢測到血清濃度升高，2 h后升高明顯，大量研究證明[8-9]：缺血缺氧是誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)S-100β蛋白基因表達(dá)的重要因素，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷較為特異和靈敏的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示IR與S組比較其濃度明顯升高（P＜0.05），說明其損傷明顯存在，并隨灌注時(shí)間延長而增加，其增加趨勢與炎癥介質(zhì)增加趨勢一致。說明損傷程度與炎癥反應(yīng)程度有相關(guān)性，而在血管生成素1干預(yù)下，能明顯降低缺血再灌注后頸靜脈血TNF-α（79.32±4.97 ng/L；）、IL-1（458.12±27.16 ng/L）的炎癥介質(zhì)含量和S-100β蛋白的血清含量（0.13±0.04 μg/L）；并能降低再灌注損傷腦水含量（82.37%± 1.29%）（P＜0.05），減輕腦水腫。從而可以進(jìn)一步認(rèn)為：血管生成素1可能通過干預(yù)炎癥反應(yīng)等途徑達(dá)到保護(hù)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的作用。這與關(guān)于血管緊張素1：可抑制炎性反應(yīng)過程中TNF-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞游出及血栓素誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞黏附和白細(xì)胞介素IL-1β等的合成［10］研究結(jié)果相符合。

因?yàn)槟X缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制為：再灌注時(shí)大量分子氧進(jìn)入缺血組織產(chǎn)生O2-、OH-等大量氧自由基激活誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的炎癥基因的表達(dá)導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子：血小板活化因子(PAF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)白細(xì)胞介素IL-1β、等表達(dá)增多，在本研究觀察再灌注2 h（T2）檢測TNF-α、IL-1β濃度明顯升高（79.32±4.97 ng/L、458.12±27.16 ng/L），且隨時(shí)間延長呈增加的趨勢，而此增加趨勢與S-100β蛋白濃度增加相一致。說明血腦屏障損傷伴隨炎癥介質(zhì)的升高即炎癥反應(yīng)發(fā)生。由于觀察時(shí)點(diǎn)選擇不同，各項(xiàng)觀察指標(biāo)何時(shí)開始升高以及何時(shí)達(dá)濃度峰值還有待于進(jìn)一步研究。炎癥介質(zhì)增加誘導(dǎo)腦受損區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、P、E選擇素表達(dá)增加，粘附分子和中性粒細(xì)胞表面的互補(bǔ)受體反應(yīng)，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞等與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，阻塞微血管，導(dǎo)致血管閉塞而引發(fā)“無復(fù)流現(xiàn)象”[11]，加重腦缺血進(jìn)而產(chǎn)生腦水腫和壞死[12]，血腦屏障緊密連接損壞、通透性增高，從而使平時(shí)不能通過血腦屏障的大分子蛋白[13]如S-100β蛋白滲出，因此腦血流中能監(jiān)測較高濃度的S-100β蛋白。

綜上所述：血管生成素1可能通過減輕腦血管炎癥反應(yīng)過程和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性來減輕腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷從而起到保護(hù)作用。對于本實(shí)驗(yàn)中觀察時(shí)點(diǎn)的選擇以及其給藥劑量和時(shí)機(jī)尚需進(jìn)一步研究。

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2013-11-13）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.05.011

*廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院麻醉科(廣州510730)

廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科