李影　張東浩

【摘要】 目的 探討尿液結核分枝桿菌檢測在腎結核診斷中的應用價值。方法 對108例已確診為腎結核的患者尿液標本分別采取抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR三種方法進行檢測， 其結果進行分析。結果 抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR檢測尿液中結核分枝桿菌的陽性率分別為25.9%、51.9%、72.2%。結論 尿液結核分枝桿菌檢測屬病原學檢測， 特異性好、操作簡便， 對腎結核的診斷有著重要的應用價值。

【關鍵詞】 尿液；結核分枝桿菌；腎結核；診斷

結核病是全球嚴重的公共衛(wèi)生問題之一， 據(jù)WHO估計， 全球有約20億人感人結核分枝桿菌， 每年有約200萬人死于結核病[1]。近年來， 隨著結核病發(fā)病率在全球范圍內的回升， 腎結核的發(fā)病率也明顯增加。據(jù)統(tǒng)計， 全球每年有近千萬人感染結核病， 而腎結核約占其中的8%～20%。該病進展隱蔽， 發(fā)現(xiàn)時， 腎功能已部分或完全喪失， 患者早期診斷困難， 以致延誤治療， 對人們的身體健康危害極大。因此早診斷對治療尤為重要。在眾多輔助檢查中， 除病理診斷外， 實驗室病原學檢查具有較高的特異性， 且操作簡便， 患者無痛苦。現(xiàn)就最常用的抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR三種檢測方法進行分析， 評價其在尿液結核分枝桿菌檢測對腎結核診斷的應用價值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年11月～2013年10月本院住院的腎結核患者， 共計108例。男性58例， 女性50例。其中小于20歲者7例， 大于40歲者27例， 20～40歲者74例， 占68.5%；單側腎結核87例， 雙側腎結核21例；合并其他臟器結核?。ㄈ绶谓Y核、脊柱結核、腸結核、附睪結核等）65例， 約占60.2%。

1. 2 標本收集

1. 2. 1 抗酸菌涂片染色檢測 留取12 h尿液， 靜置， 傾去上清液， 留取沉淀部分30 ml， 以3000 rpm離心30 min， 棄上清， 取沉淀物涂片。

1. 2. 2 改良羅氏培養(yǎng)和熒光定量PCR檢測 囑患者留取晨尿， 因晨尿濃縮， 適用于做病原學檢查。在留取尿液之前先用消毒液清洗外陰， 以去除污染菌。分別留取中段尿約20～30 ml于一次性無菌塑料標本杯中各一杯。為提高檢出率， 所有患者均連續(xù)留取3 d標本， 置于2～8℃冰箱中貯存， 于3 d后將尿液混合進行改良羅氏培養(yǎng)和熒光定量PCR檢測。如患者正在進行抗結核藥物治療時， 應停用所有抗結核藥一周， 以提高結核桿菌的檢出率。

1. 3 試劑與儀器

1. 3. 1 抗酸菌涂片染色 試劑由珠海貝索生物技術有限公司提供。無需特殊儀器。

1. 3. 2 羅氏培養(yǎng) 改良酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術有限公司提供。隔水式培養(yǎng)箱由天津市泰斯特儀器有限公司提供。

1. 3. 3 熒光定量PCR 由中山大學達安基因股份有限公司提供試劑。儀器LightCycler 3.5全自動熒光定量基因擴增儀由羅氏公司提供。

1. 4 方法

1. 4. 1 抗酸菌涂片染色 取制備好的尿沉淀物0.05～0.10 ml均勻涂于玻片上， 直徑約2～3 cm， 火焰固定。滴加石碳酸復紅染液布滿標本， 保持3～5 min。流水自玻片一端沖洗洗去染液， 瀝干剩余水分。滴加3%的鹽酸酒精， 1～3 min后流水沖洗瀝干。滴加美藍染液， 0.5～1 min后流水沖洗瀝干。置于干燥箱中干燥后鏡檢。

1. 4. 2 改良羅氏培養(yǎng) 將標本進行離心， 以2000 rpm/min離心3 min為宜， 取離心沉淀后的尿沉渣標本0.1～0.3 ml， 以無菌操作接種于培養(yǎng)基斜面上， 一般每份標本同時接種2支培養(yǎng)管。將接種好的培養(yǎng)管置于35～37℃培養(yǎng)箱中孵育， 5%～10%的CO2可以促進分枝桿菌的生長， 培養(yǎng)管須松蓋傾斜放置24 h后再將蓋子鎖緊， 垂直放置。接種并孵育第一周需每天判讀一次菌落生長情況。此后每周判讀一次， 記錄菌落生長及污染情況。判讀如發(fā)現(xiàn)斜面培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn)， 須挑取菌落做成涂片進行抗酸染色鏡檢。

1. 4. 3 熒光定量PCR 取底部尿液標本10～15 ml離心管中15000 rpm離心5 min。去上清， 沉淀加無菌生理鹽水1 ml打勻， 15000 rpm離心5 min， 去上清。加50 μl DNA提取液充分混勻， 100℃浴溫10 min， 待自然冷卻后， 10000 rpm離心5 min， 取上清液2 μl加入專用毛細管中4000 rpm離心3 min， 插入圓形卡盤倒置20 s后放入儀器中進行循環(huán)擴增。步驟為：93℃→2 min預變性， 然后按照93℃5 s→57℃45 s， 做40個循環(huán)， 最后置37℃延伸1 s。整個過程嚴格執(zhí)行無菌操作， 擴增及結果判讀， 由電腦自動完成。

2 結果

三種方法檢測尿液結核分枝桿菌的陽性檢出率分別為抗酸菌涂片染色法25.9%（28/108）， 改良羅氏培養(yǎng)法51.9%（56/108）， 熒光定量PCR法72.2%（78/108）。

3 討論

近年來臨床不典型腎結核發(fā)病率有增加的趨勢[2]， 此外， 超過1/2的腎結核患者伴有全身其他部位的結核菌感染， 所以發(fā)現(xiàn)全身其他部位的結核病灶時， 應進行全面檢查是否存在腎結核等結核性疾病， 而全身其他部位的結核病灶也支持腎結核的診斷。

在腎結核的診斷方法中， 主要為影像學檢查和病原學檢查。影像學檢查中， B超檢查對早期腎結核的診斷意義不大， 只適合腎結核初篩和治療后的復查[3]。IVU或CT的典型表現(xiàn)對中晚期腎結核具有確診價值[4]。因此， 病原學檢查對腎結核的早期診斷尤為重要。

抗酸菌涂片染色檢查是實驗室最基本的細菌學檢查方法。其優(yōu)點是操作簡便、快速， 無需任何設備， 廉價， 1～2 h即可回報結果， 對結核病早期診斷和病程的發(fā)展、轉歸起著重要作用；缺點是受人為因素影響大， 靈敏度低， 檢出率一般只有25%～28%。通常需5000～10000條菌/ml才能得到陽性結果。endprint

改良羅氏培養(yǎng)法的優(yōu)點是靈敏度較高， 不易被污染， 特異性好， 操作簡便， 無需特殊儀器設備， 并可結核抗酸菌涂片檢測來鑒定死菌與活菌， 還可以進一步藥物敏感性的鑒定， 為臨床用藥提供可靠依據(jù)， 被譽為結核病診斷的“黃金標準”；缺點是費用高， 操作流程長， 通常需6～8周才能獲得結果。

熒光定量PCR是一種密閉的擴增檢測系統(tǒng)， 所檢測的是結核分枝桿菌的特異DNA片段， 具有敏感度、特異度高及方便快速、自動化程度高等優(yōu)點， 特別是對難以培養(yǎng)與生長緩慢的結核桿菌的檢測更有優(yōu)勢[5]。只需極少量的病原標本， 即可及時準確的判定結果。陽性下限僅為10個拷貝/ml， 操作簡單， 只需2～3 h即可完成。缺點是實驗室環(huán)境要求極高（需按照相關法律法規(guī)的標準建設實驗室并提交主管部門審批合格）， 因其檢出率高， 故而極微量的污染就可能造成假陽性結果。因此需聯(lián)合多項實驗室檢查可以提高腎結核診斷的特異性和敏感性。

綜上所述， 尿液結核分枝桿菌的檢測是診斷腎結核的關鍵， 且尿標本簡單易取， 取樣不會給患者帶來痛苦和增加感染機會， 特異性好， 靈敏度較高， 對腎結核的早期診斷有明顯的優(yōu)勢。因此， 不難看出尿液結核分枝桿菌檢查對臨床腎結核以致泌尿系結核的診斷具有無可替代的重要作用。

雖然尿液結核分枝桿菌檢測對腎結核的診斷發(fā)揮著相當重要的作用， 但其檢測方法的的靈敏度和特異性還有待進一步提高， 且易出現(xiàn)假陰性和假陽性。因此， 完整的腎結核診斷仍然需要將病史、臨床表現(xiàn)、實驗室檢測、影像學分析、病理學診斷等方法相結合進行綜合分析， 才能提高腎結核早期診斷率， 為進一步的正規(guī)抗結核治療贏得時機。

參考文獻

[1] 張瑛，孫亞蒙，徐欣暉，等.結核感染T細胞斑點試驗再結核性疾病中的診斷價值.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）， 2010， 12（4）：2431-2434.

[2] 石鶯，黃建軍.45例腎結核臨床病理分析.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2005， 2（21）：133-135.

[3] 李邦國，戴輝，蔡爭，等.腎盂造影、CT對腎結核的診斷價值.醫(yī)學理論與實踐， 2005，18（1）：132-133.

[4] 裴林惠，丁建國.腎結核的CT診斷.中國基層醫(yī)藥， 2006， 11（1）：32-33.

[5] 彭麗，羅永艾.結核病的實驗室快速診斷.新醫(yī)學， 2005， 36（1）： 359-361.endprint