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        一種簡便的機械法分離綿羊睪丸間質(zhì)細胞的研究

        2014-04-19 07:16:58李鵬飛姜曉龍陳建偉姚曉磊趙妙妙呂麗華
        黑龍江動物繁殖 2014年5期
        關鍵詞:密度梯度活率睪酮

        黃 洋,靳 輝,曹 霞,李鵬飛,姜曉龍,陳建偉,姚曉磊,趙妙妙,呂麗華

        (山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院,山西 太谷030801)

        睪丸間質(zhì)細胞(Leydig cell) 分布于睪丸曲精細管之間的間隙內(nèi),是一類含量很少的細胞,約占睪丸內(nèi)總細胞數(shù)的2% ~4%[1]。睪丸間質(zhì)細胞最重要的功能是分泌睪酮,其睪酮分泌受下丘腦-垂體-睪丸性腺軸的調(diào)節(jié),睪丸間質(zhì)細胞分泌的睪酮占動物體內(nèi)總量的95%左右[2]。因為睪酮與靶器官受體結合后會發(fā)揮重要生理功能[3],所以睪丸間質(zhì)細胞作為分泌睪酮最主要的細胞,其分離培養(yǎng)受到人們的重視。

        根據(jù)國內(nèi)外文獻報道,睪丸間質(zhì)細胞的分離主要用酶消化法。此法先用胰酶與膠原酶消化睪丸組織后,再用Percoll 進行連續(xù)密度梯度離心或用尼龍網(wǎng)過濾分離[4~8]。但是此方法費時費力,整個操作流程費時近2 h,造成間質(zhì)細胞死亡率上升。因此,本文將探討一種更為省時的方法來分離綿羊睪丸間質(zhì)細胞。

        1 材料與方法

        1.1 試驗動物及睪丸樣品

        睪丸樣品取自于當?shù)赝涝讏鐾涝椎某赡晷坌跃d羊。

        1.2 主要試劑

        脫氫表雄酮(DHEA) 、尼克酰胺、DMSO、臺盼藍等購于Sigma 公司; 硝基藍四氮唑(NBT) 購于Amresco 公司; 煙堿腺苷二核苷酸(NAD) 購于Roche 公司; DMEM、FBS、雙抗購于Gibco 公司。

        1.3 綿羊睪丸間質(zhì)細胞的分離

        將采集到的綿羊睪丸放入4 ℃PBS 緩沖液內(nèi),2 h 內(nèi)帶回實驗室。先用無菌PBS 將睪丸表面沖洗干凈,然后將睪丸放入75%酒精內(nèi)30 s 進行消毒。將睪丸被膜用剪刀剪開,用鑷子將睪丸被膜撕去。用手術刀將睪丸切成2 cm3左右的小塊,將睪丸小塊放入預先裝有無菌PBS 的50 mL 離心管內(nèi),放在搖床上震蕩20 min,使得睪丸內(nèi)曲精細管組織松散開,間質(zhì)細胞脫落。震蕩完成后,將離心管靜置5 min。此時容器內(nèi)物質(zhì)分層,上層為富含間質(zhì)細胞的懸液,下層為睪丸曲精細管組織。取出上清液,1000 r/min 離心5 min。離心后去除上清,用含1% 雙抗、10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸細胞。將重懸的細胞接種入培養(yǎng)瓶內(nèi),32 ℃培養(yǎng)3 h。3 h后將未貼壁的細胞倒掉,剩余細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h,以供間質(zhì)細胞純度鑒定。

        1.4 綿羊睪丸間質(zhì)細胞的活率及純度鑒定

        細胞活率鑒定采用臺盼藍染色法。將上一步分離的細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液體積比1∶1 混合,常溫孵育約2 min 后,將細胞懸液涂抹于血細胞計數(shù)板上進行鏡檢?;罴毎恢?,死細胞呈藍色。

        間質(zhì)細胞純度鑒定采用3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD) 染色法。染色液的配制方法為: 將DHEA 與NBT 共同溶于DMSO 中,兩者終濃度皆為10 mg/mL,記為A 液; 將NAD 溶于 PBS 緩沖液中,終濃度為10 mg/mL,記為B 液; 將尼克酰胺溶于PBS中,終濃度為1 mg/mL,記為C 液。使用時將10 μL A 液、100 μL B 液、100 μL C 液與790 μL PBS 緩沖液配制為1 mL 新鮮的染色液。

        在96 孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h 后的細胞,棄去培養(yǎng)液,每孔加入100 μL 的新鮮染色液,32 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后鏡檢。呈藍黑色的細胞為間質(zhì)細胞。

        2 結果

        2.1 綿羊間質(zhì)細胞的活率

        經(jīng)臺盼藍染色后鏡檢觀察,約40 %的細胞死亡,顯示為藍色。細胞活率約為60%。如圖1 所示。

        2.2 綿羊間質(zhì)細胞的純度

        圖1 臺盼藍染色鑒定細胞活率100 ×

        經(jīng)3β- HSD 染色劑對細胞染色后,視野下幾乎所有細胞都呈藍黑色,純度高達90%以上。如圖2 所示。

        圖2 間質(zhì)細胞純度鑒定(100 ×)

        3 討論

        綿羊睪丸間質(zhì)細胞的分離純化在雄性綿羊生殖研究中非常重要,一種簡便快捷且純度高的分離方法將大大提高科研人員的工作效率。傳統(tǒng)上分離間質(zhì)細胞較為復雜,需要酶消化和密度梯度離心。酶消化與密度梯度離心都是較為耗時的工作,使得間質(zhì)細胞的死亡率大幅上升。但是我們覺得間質(zhì)細胞在睪丸中較為松散,不需要酶消化。

        另外,間質(zhì)細胞主要存在于曲精細管之間的間隙內(nèi),在保證曲精細管大致完整的情況下,曲精細管內(nèi)的細胞是不會與間質(zhì)細胞混合的。因此本試驗根據(jù)經(jīng)驗省去了酶消化與密度梯度離心的步驟。結果正如我們所預料的那樣,睪丸間質(zhì)細胞的純度很高,能達到90%以上。但是本試驗分離的細胞活率只有60%左右,這應該是由于采樣地點離實驗室太遠所致。從采集睪丸到運至實驗室花費了近2 h。如果能把運輸時間降下來,也許活率會大幅提升。這一點在將來還需要繼續(xù)研究。

        [1]劉建中,郭海彬,鄧春華,等.大鼠睪丸Leydig 細胞的培養(yǎng)和鑒定[J].中華男科學雜志,2006,12(1) : 14-18.

        [2]Syed G H.Cell Biology of Leydig Cells in the Testis [J].International Review of Cytology,2004,4: 181-241.

        [3]Yang J Y,Zhang Y F,Wang Y Q,et al.Toxic effects of zearalenone and alpha-zearalenol on the regulation of steroidogenesis and testosterone production in mouse leydig cells [J].Toxicol Vitro,2007,21(4): 558-565.

        [4]應鋒,龔昳,孫佳音,等.大鼠睪丸間質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)、鑒定與功能監(jiān)測[J].中華男科學雜志,2008,1(14) : 7-10.

        [5]吳婷,張煒,睦元庚.體外培養(yǎng)的人睪丸間質(zhì)細胞對絨毛膜促性腺激素刺激的反應[J].南京醫(yī)科大學學報,2003,2: 132-133.

        [6]West A P,Rose M P,Cook B A.Induction of lutropin receptors by lutropin and cyclic AMP in cultured mouse tumour(MA10) leydig cells [J].Biochem J,1990,2: 499-503.

        [7]柳海燕,王大勇,時姍姍,等.GnRH 類似物對大鼠睪丸間質(zhì)細胞MAPK 的影響[J].2010,16(3) :212-216.

        [8]高慧艷,李春陽,蘇曉東,等.氯化錳對大鼠睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成及去勢大鼠生殖內(nèi)分泌的影響[J].2010,45(3) : 419-422.

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