寧博林，徐 澤，李 悅，韓興龍，汪志軍，王秋實(shí)，李井春

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

隨著胚胎生物工程技術(shù)的發(fā)展，如動(dòng)物體外受精、克隆、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，都面臨胚胎體外囊胚發(fā)育率低和質(zhì)量差的問(wèn)題［1，2］，其關(guān)系到整個(gè)胚胎工程產(chǎn)業(yè)的成敗。然而，早期胚胎體外培養(yǎng)大多數(shù)研究主要集中在胚胎發(fā)育所需要的培養(yǎng)液上，卻忽略了早期胚胎在體內(nèi)輸卵管中發(fā)育所需要的物理性因素，即發(fā)育的微環(huán)境及機(jī)械性力刺激的影響。早期胚胎在輸卵管中既需要胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也同時(shí)受到輸卵管蠕動(dòng)時(shí)的擠壓力、輸卵管液流動(dòng)的層流剪切力以及與上皮纖毛接觸的摩擦力等的作用。如何在體外模擬輸卵管對(duì)早期胚胎發(fā)育的物理性刺激的微環(huán)境成為問(wèn)題的關(guān)鍵。這樣就想到了微流控芯片技術(shù)，其是20 世紀(jì)90年代初，基于微電子、微機(jī)械、生物工程和納米技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種新的研究技術(shù)［3，4］。

Akagi 等［5］利用PDMS 制作顯微小室的顯微培養(yǎng)盤(pán)，利用其培養(yǎng)早期胚胎時(shí)，囊胚發(fā)育率和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)明顯高于常規(guī)的液滴培養(yǎng)法。最近，日本研究者使用振搖胚胎培養(yǎng)刺激裝置對(duì)小鼠和人的胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，取得良好的培養(yǎng)效果。推測(cè)可能是通過(guò)振搖物理刺激有利于胚胎自身分泌的促進(jìn)胚胎發(fā)育因子在胚胎間擴(kuò)散及相互作用，同時(shí)也有利于胚胎代謝產(chǎn)物排出［6］。Chae Yun Bae等［7］應(yīng)用微流控培養(yǎng)裝置對(duì)牛的胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)施加不同大小機(jī)械力的刺激，在適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力刺激下能夠明顯增加囊胚發(fā)育率。目前，在國(guó)內(nèi)應(yīng)用微流控芯片模擬輸卵管進(jìn)行早期胚胎的研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微流控芯片技術(shù)模擬早期胚胎體內(nèi)發(fā)育的微環(huán)境制作了胚胎體外培養(yǎng)微流控芯片裝置并施加適當(dāng)?shù)奈锢硇源碳?，探究胚胎體外培養(yǎng)微流控芯片對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育率及質(zhì)量的影響，為早期胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)改良提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小白鼠(雄性12 ～16 周齡，雌性6 ～8 周齡) 來(lái)自于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物繁殖教研室，自繁，自由飲水，自由采食，12 ～14 h 光照，室溫20 ～26 ℃。

1.2 主要試劑與儀器

試劑有m CZB 液(自制) 見(jiàn)表1、孕馬血清促性腺激素(PMSG，寧波激素廠) 、人絨毛膜促性腺激素(HCG，寧波激素廠) 、谷胱甘肽、道康寧-184 預(yù)聚體和凝固劑(美國(guó)產(chǎn)，PDMS) 等; 儀器包括二氧化碳培養(yǎng)箱、真空脫泡器、實(shí)體顯微鏡、干燥箱等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微流控芯片培養(yǎng)盤(pán)的制備

一次性鑄模構(gòu)建微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置，預(yù)先設(shè)計(jì)并制作模具，將PDMS 預(yù)聚體和凝固劑混合好(v/v 為10 ∶1) ，脫泡處理后，澆鑄在模具中，放入干燥箱中升溫到75 ℃，30 min，處理后將模具拆下，這樣微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置就制備完成，備用(制作過(guò)程見(jiàn)圖1) 。

圖1 一次性成型的微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置示意圖與實(shí)物圖

1.3.2 微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置系統(tǒng)的構(gòu)成

主要由微流控芯片培養(yǎng)盤(pán)、微流控芯片培養(yǎng)裝置振動(dòng)系統(tǒng)等組成，具體見(jiàn)圖2。

圖2 胚胎體外培養(yǎng)微流控芯片裝置示意圖

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 微流控芯片培養(yǎng)裝置對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育率的影響

將小鼠的受精卵隨機(jī)分成三組，分別為: 對(duì)照組1 為常規(guī)液滴培養(yǎng)組(CZB 培養(yǎng)液) 、對(duì)照組2 為CZB +谷胱甘肽微滴培養(yǎng)組、微流控芯片培養(yǎng)組。CZB +谷胱甘肽組為在CZB 培養(yǎng)液中添加5 mmol/L 的谷胱甘肽; 微流控芯片培養(yǎng)組培養(yǎng)液為在CZB 培養(yǎng)液中添加5 mmol/L 的谷胱甘肽并且在微流芯片中進(jìn)行培養(yǎng)。將三組的結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.4.2 微流控芯片培養(yǎng)裝置對(duì)小鼠早期囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

將對(duì)照組和微流控芯片組培養(yǎng)得到的囊胚經(jīng)過(guò)H33342 染色后，利用熒光顯微鏡觀察，記錄細(xì)胞數(shù)。比較兩組的差異性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用StatView 5.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。當(dāng)P ＜0.05 時(shí)差異顯著，肩標(biāo)字母不同表示差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 微流控芯片培養(yǎng)裝置對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育率的影響

由表1 可知，對(duì)照組1 與對(duì)照組2 中2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、8-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率、囊胚發(fā)育率都差異顯著(P ＜0.05) 。對(duì)照組1 與微流芯片組中2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、8-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率、囊胚發(fā)育率都差異顯著(P ＜0.05) 。對(duì)照組2 與微流控芯片組中2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率差異不顯著(P ＞0.05) ，但是，在8-細(xì)胞胚胎發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率都差異顯著(P ＜0.05) 。

表1 微流控芯片培養(yǎng)裝置對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育率的影響

2.2 微流控芯片培養(yǎng)裝置對(duì)小鼠早期囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

從表2 可以看出，微流控芯片組與液滴培養(yǎng)組在囊胚總細(xì)胞數(shù)存在顯著差異(P ＜0.05) 。

表2 微流控芯片培養(yǎng)裝置對(duì)小鼠早期囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

3 分析與討論

我們采用的一次性鑄型微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置制備方法與常規(guī)的制作方法進(jìn)行比較，操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，也不會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液滲漏的現(xiàn)象。

微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育率影響的結(jié)果見(jiàn)表1。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果上可以看出，谷胱甘肽添加到培養(yǎng)液中可以在一定程度上克服小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯的問(wèn)題，所以液滴培養(yǎng)法，在添加谷胱甘肽時(shí)，與沒(méi)有添加谷胱甘肽組相比，卵裂率上存在顯著差異，這也說(shuō)明添加谷胱甘肽可以作為一種有效的抗氧化劑克服小鼠早期胚胎發(fā)育的阻滯問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果與方南洙［8］等發(fā)表的結(jié)果一致。所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微流控芯片培養(yǎng)裝置進(jìn)行小鼠早期培養(yǎng)時(shí)，所用的培養(yǎng)液中也添加谷胱甘肽。

有學(xué)者報(bào)道，多個(gè)胚胎在少量的培養(yǎng)液中同時(shí)培養(yǎng)有利于胚胎發(fā)育，增加囊胚總細(xì)胞數(shù)目，促進(jìn)胚胎移植后的存活。主要是因?yàn)檫@些胚胎產(chǎn)生了有益的促生長(zhǎng)因子，從而刺激其自身和周?chē)咛サ陌l(fā)育。當(dāng)在少量的培養(yǎng)液中增加胚胎的數(shù)量時(shí)會(huì)使促進(jìn)生長(zhǎng)因子的濃度增加，作用更強(qiáng)［9］。當(dāng)然，過(guò)多的胚胎在太少量的培養(yǎng)液中培養(yǎng)也是有害的，會(huì)產(chǎn)生更多的氨和氧自由基物質(zhì)，最佳的范圍應(yīng)該是每個(gè)胚胎0.5 ～2 μL［10，11］。而一個(gè)動(dòng)態(tài)的微觀培養(yǎng)體系可以及時(shí)地將有害物質(zhì)排出去。微流控芯片胚胎體外培養(yǎng)裝置可以滿足早期胚胎體外發(fā)育的微環(huán)境的要求。由表1 還可觀察出，CZB +谷胱甘肽組和微流芯組在2 細(xì)胞期前胚胎發(fā)育率差異不顯著，但從8-細(xì)胞期開(kāi)始微流芯片組胚胎發(fā)育率較高。分析原因應(yīng)該是微流芯片組施加了適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激，促進(jìn)了胚胎的發(fā)育。從表2可以看出，微流控芯片組顯著提高小鼠囊胚總細(xì)胞數(shù)，這可能是利用微流控芯片培養(yǎng)裝置進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)過(guò)程中施加一定的物理性刺激有利于胚胎細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。同時(shí)，也促進(jìn)各胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的有益生長(zhǎng)因子的擴(kuò)散，彼此之間促進(jìn)生長(zhǎng)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，利用PDMS 生物相容性好、透明度高、無(wú)毒性的材料制作胚胎體外培養(yǎng)裝置模擬輸卵管結(jié)構(gòu)，微流控芯片胚胎體外培養(yǎng)裝置可以滿足小鼠早期胚胎體外發(fā)育的微環(huán)境的要求，也能對(duì)胚胎施加適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性刺激，在體外模擬輸卵管是可行的。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中PDMS 一次鑄造成型芯片操作簡(jiǎn)單，且不易出現(xiàn)培養(yǎng)液外漏的現(xiàn)象。所以PDMS 一次性鑄造成型的微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置是可行的。應(yīng)用一次性鑄型的微流控芯片胚胎培養(yǎng)裝置進(jìn)行小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)，顯著提高了小鼠體外囊胚發(fā)育率。

［1］馬學(xué)海，張居農(nóng).牛體外受精胚胎的體外培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)奶牛，2007，1: 29-31.

［2］周艷華，蘇雷.奶水牛卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)胚胎體外發(fā)育潛能的研究.中國(guó)奶牛，2008，10:31-35.

［3］Yi CQ，Li CW，Ji SL，et al.Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells.2006，560(1-2) : 1-23.

［4］Viravaidya K，Shuler ML.Incorporation of 3T3- L1 cells to mimic bioaccumulation in a microscale cell culture analog device for toxicity studies.Biotechnology Progress，2004，20(2) : 590-597.

［5］Satoshi AKAGI，et al.Culture of bovine embryos on a polydimethylsiloxane (PDMS) microwell plate.Jounal of reproduction and development 2010，56: 475-479.

［6］Koji Matsuura，Keiji Naruse，et al.Improved development of mouse and human embryos using a tilting embryo culture system.Reproductive BioMedicine Online.2010，20(3) : 358-364.

［7］Chae Yun Bae，Minseok S.Kim，et al.Mechanical stimulation of bovine embryos in a microfluidic culture platform.Bihip J.(2011) 5(2) : 106-113.

［8］方南洙，李鐘淑，金一，等.活性氧對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的影響［J］.中國(guó)畜牧雜志，2005，41(7)36-37.

［9］Lane M，Gardn er DK.Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of mouse embryos in vitro ［J］.Hum Reprod，1992，7(4) :558- 562.

［10］Paria BC，Dey SK.Preimplantation embryo development in vitro: cooperat iveinteractions among embryos and role of growth factors.Pr Natl Acad Sci USA，1990，87(12) : 4756-4760.

［11］Gil MA，Ab eydeera LR，Day BN，et al.Effect of the volume of medium and number of oytes during in vitro fertilization on embryo development in pigs ［J］.Theriogenology，2003，60: 767-776.