趙仕勇　林先耀　王娟　吳亦棟　祁正紅　邵啟民　崔大偉

麻疹患兒糞便麻疹病毒核酸的檢測及臨床意義

趙仕勇林先耀王娟吳亦棟祁正紅邵啟民崔大偉

【摘要】目的探討麻疹患兒腸道排毒情況和糞便病毒核酸快速檢測的臨床意義。方法38例臨床診斷麻疹患兒，入院時(shí)均有發(fā)熱、皮疹等麻疹感染癥狀。在入院2d內(nèi)同時(shí)采集咽拭子和糞便標(biāo)本。標(biāo)本在冷鏈條件下送傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，采用RT-PCR法檢測麻疹病毒核酸及Ct值。同時(shí)對部分咽拭子和糞便標(biāo)本擴(kuò)增均陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序。結(jié)果38例患兒糞便麻疹病毒核酸陽性37例，占97.4%，Ct值23.8±3.04；咽拭子病毒核酸陽性35例，占92.1%，Ct值28.0±4.0。兩者陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.029，P＞0.05）；兩組Ct值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.23，P＜0.05）。3例患兒咽拭子和糞便標(biāo)本的麻疹病毒基因型（均為H1a基因亞型）和核苷酸序列完全一致。結(jié)論糞便病毒核酸快速檢測與咽拭子標(biāo)本具有相同的臨床診斷價(jià)值，糞便病毒核酸拷貝數(shù)高于咽拭子病毒核酸，且糞便標(biāo)本的采集具有方便、無痛苦，依從性好，不易受人為因素的影響，值得推廣。

【關(guān)鍵詞】麻疹糞便病毒核酸熒光定量RT-PCR

麻疹是由麻疹病毒（Measles virus，MV）引起的一種以發(fā)熱、呼吸道癥狀和出疹為特征的急性呼吸道傳染病,嚴(yán)重危害兒童健康。我國進(jìn)行麻疹疫苗計(jì)劃免疫之后,該病的發(fā)病率明顯下降，但是近年來其發(fā)病率和病死率又呈現(xiàn)上升趨勢。早期明確實(shí)驗(yàn)室診斷有利于早期防控和及時(shí)救治。目前病毒診斷和排毒規(guī)律研究最多的是采用咽拭子標(biāo)本。我院采用RT-PCR法直接測定麻疹患兒糞便MV核酸，探討麻疹患兒腸道排毒情況和糞便病毒核酸快速檢測的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料和方法

1.1一般資料選擇2013-03—06我院感染科住院資料完整的麻疹患兒38例，診斷符合諸福棠《實(shí)用兒科學(xué)》第7版的相關(guān)定義。入院時(shí)均有發(fā)熱、皮疹等麻疹感染癥狀，均無接種麻疹疫苗史。病例組，男25例，女13例；最小2個(gè)月，最大6歲；≤8個(gè)月32例，＞8個(gè)月6例。在入院2d內(nèi)同時(shí)采集咽拭子和糞便標(biāo)本。擇同期住院普通嬰幼兒下呼吸道感染患兒38例糞便標(biāo)本作為對照組，男24例，女14例；年齡4～8個(gè)月30例，9～24個(gè)月8例。兩組性別、年齡均有可比性（均P＞0.05）。

1.2標(biāo)本的采集和運(yùn)送咽拭子和糞便標(biāo)本在冷鏈條件下送傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測MV核酸。樣本的采集、運(yùn)輸?shù)染鶇⒄?009年中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《全國麻疹監(jiān)測方案》。

1.2.1標(biāo)本處理和病毒核酸提取取咽拭子采集管中200μl病毒液，按照VR100病毒核酸提取試劑盒（中國臺灣Geneaid公司）說明書操作抽提MV核酸，收集終體積為50μl的核酸提取液，-80℃保存。

1.2.2糞便標(biāo)本處理取0.2g或200μl糞便樣本加到EP管中，加入0.9%氯化鈉溶液1.5ml，震蕩混勻3次，每次10s，然后靜置10min，以8 000r/min離心5min，吸取200μl上清液加到EP管中，進(jìn)行核酸提取，-80℃保存。酶標(biāo)儀是美國BIO-RAD公司的RIMARK酶標(biāo)儀。1.3檢測方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)參考美國CDC和相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]，根據(jù)GenBank中MV基因序列號（NM_KC164757.1），采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增MV的N基因C末端的594個(gè)核苷酸（bp）片段的引物，引物由上海生工公司合成。上游引物（MV-60）:5＇-GCTATGCCATGGGAGTAGGAGTGG-3＇；下游引物（MV-63）：5＇-CCTCGGCCTCTCGCACCTAGT-3＇。

1.3.2MV核酸檢測采用RT-PCR法，按照試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書操作，將MV核酸逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5μl，dNTP mixture（各2.5mmol/L）2.0μl，TaKaRaTaq酶（5U/μl）0.15μl，10 μmol/L上、下游引物各1μl，cDNA 3μl，ddH2O補(bǔ)足至25μl。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，53℃45s，72℃1min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃終止反應(yīng)。分別以滅菌ddH2O和實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的MV核酸作為陰、陽性對照的模板。PCR產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照。

1.3.3分析條件和結(jié)果判斷陰性對照：核酸提取時(shí)以滅菌雙蒸水代替標(biāo)本。陽性對照：提取好的陽性核酸作為模板RNA。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。Ct值無數(shù)值的標(biāo)本為陰性樣本；Ct值＜35.0的樣本為陽性；Ct值≥35.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。

1.3.4基因測序選擇3例咽拭子和糞便標(biāo)本擴(kuò)增均陽性的PCR產(chǎn)物委托深圳華大基因杭州分公司對基因序列進(jìn)行雙向測定。測序結(jié)果用DNAMAN（5.1.0.0）與Sequencher 4.7軟件進(jìn)行序列的拼接、比對和分析，利用MEGA4.0軟件與DNAstar 5.1對MV的N基因C末端456個(gè)核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，測得計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1咽拭子和糞便標(biāo)本病毒核酸陽性率和Ct值的比較病例組咽拭子病毒核酸陽性35例占92.1%，Ct值28.0±4.0；而糞便病毒核酸陽性37例占97.4%，Ct值23.8±3.04。兩者陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.029，P＞0.05）；兩組Ct值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 5.23，P＜0.05）。說明糞便病毒核酸拷貝數(shù)高于咽拭子病毒核酸。見圖1。對照組咽拭子、糞便MV核酸均陰性。

圖1　MV N基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖（M：DNA marker DL2 000；1：陰性對照；2～5：麻疹患者標(biāo)本；6：陽性對照）

2.2基因測序結(jié)果3例患兒咽拭子和糞便標(biāo)本的MV基因型（均為H1a基因亞型）和核苷酸序列完全一致，見圖2。

圖2　MV基因測序圖

3　討論

盡管在全球和地區(qū)水平上麻疹疫苗接種覆蓋率穩(wěn)定上升，而且報(bào)道的加強(qiáng)免疫覆蓋率提高，但是2010年全球麻疹病例數(shù)仍然在上升[1]。國家衛(wèi)生計(jì)生委公布我國2012年麻疹發(fā)病數(shù)6 183例，死亡數(shù)8例；2013年麻疹發(fā)病數(shù)27 646例，死亡數(shù)24例；發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)均增加3倍以上。其中兒童麻疹的發(fā)病率占很大比例。麻疹是一種傳染性很強(qiáng)的急性呼吸道傳染病，也是我國法定的乙類傳染病之一，典型病例可根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合流行病學(xué)作出診斷。由于麻疹的臨床表現(xiàn)與其他部分呼吸道感染非常相近，接種過疫苗或使用過其他免疫增強(qiáng)劑后感染MV的不典型病例占較大的比例，這些均給麻疹的診斷帶來一定困難，也在一定程度上影響了麻疹治療和防疫工作的及時(shí)性，故麻疹的早期診斷、早期隔離尤為重要。MV感染最常見、最明顯的病理特征是多核巨噬細(xì)胞的形成，MV巨細(xì)胞可在呼吸道分泌物、尿液和黏膜表面如喉部、鼻腔、尿液、頰黏膜和結(jié)膜中找到，其出現(xiàn)的時(shí)間以出疹前2d至出疹后1d最為多見，此時(shí)采集上述各部位標(biāo)本進(jìn)行檢測，有助于臨床對MV感染做出早期診斷[2]。目前臨床診斷麻疹的實(shí)驗(yàn)室手段主要是用ELISA法檢測MV特異性IgM抗體，但在感染初期以及免疫功能低下的患者中該抗體的滴度較低，ELISA法檢測可能為陰性。近年發(fā)展起來的RT-PCR方法檢測病毒核酸具有直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高、易操作和時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，更適用于病例的早期確診，以便在短時(shí)間內(nèi)快速作出診斷。出疹3d內(nèi)麻疹患者咽拭子標(biāo)本中檢出MV核酸為92.86%（13/14），顯著高于病毒分離法的42.86%和ELISA法的71.43%[2]。張淑芹等[3]報(bào)道不典型麻疹患者咽拭子、尿殘?jiān)麺V抗原檢出率分別為82.4%和94.1%，表明咽拭子和尿殘?jiān)鼧?biāo)本MV抗原檢測對不典型麻疹的早期診斷有重要價(jià)值。同時(shí)說明麻疹患兒從咽部和尿排毒。本研究應(yīng)用RT-PCR對麻疹患兒糞便標(biāo)本進(jìn)行MV核酸檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率達(dá)97.4%，高于咽拭子檢測的病毒核酸陽性率，雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但至少說明糞便標(biāo)本檢測MV核酸與咽拭子標(biāo)本有相同的臨床意義，尤其對咽拭子標(biāo)本陰性患兒有重要診斷價(jià)值。因咽拭子采集的質(zhì)量與操作人員的技術(shù)密切相關(guān),每個(gè)人采集的部位、涂抹的次數(shù)多少不同,其病毒分離成功率會(huì)有較大差異[4]，故易對標(biāo)本檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。而糞便病毒核酸快速檢測方法（RT-PCR）方便可行，患兒依從性更好，且特異性及敏感性均高，可在發(fā)熱初期患兒的糞便標(biāo)本中檢測出MV，同時(shí)不受標(biāo)本量的限制，更適合作為早期診斷的實(shí)驗(yàn)室檢查依據(jù)，為臨床醫(yī)生的診斷提供幫助。同時(shí)說明MV可經(jīng)腸道排泄。黃芳等[5]報(bào)道甲型H1N1流感患者糞便標(biāo)本病毒核酸陽性率為57.14%（8/14）；陽性標(biāo)本采樣時(shí)間為發(fā)病后1～4d，說明發(fā)病早期糞便標(biāo)本也可檢出甲型H1N1流感病毒，但糞便標(biāo)本的病毒核酸陽性持續(xù)時(shí)期短于咽拭子標(biāo)本，說明甲型H1N1流感通過消化道排毒時(shí)期短于呼吸道的咽部。麻疹患兒通過消化道排毒時(shí)期是否短于呼吸道的咽部有待于進(jìn)一步研究。另本研究發(fā)現(xiàn)麻疹患兒糞便病毒核酸Ct值低于咽拭子，說明糞便標(biāo)本病毒拷貝數(shù)高于咽拭子標(biāo)本。至于糞便病毒陽性與疾病時(shí)間的相關(guān)性還有待深入研究。

總之，麻疹患兒病毒可通過腸道排泄，應(yīng)用RTPCR快速檢測麻疹患兒糞便病毒核酸與咽拭子標(biāo)本具有相同重要的診斷價(jià)值，而檢測糞便標(biāo)本具有采集方便、患兒依從性好、不易受人為因素的影響等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室診斷麻疹的重要方法之一，建議臨床推廣應(yīng)用。至于麻疹患兒病毒通過腸道排泄持續(xù)時(shí)間有待進(jìn)一步研究明確。

4　參考文獻(xiàn)

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[3]張淑芹,趙文靜,王瑩,等.間接免疫熒光法檢測[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志,2010,4(4):390-394.

[4]孫英杰,余宏杰,馬艷,等.麻疹病人不同標(biāo)本的麻疹病毒分離結(jié)果[J].中國計(jì)劃免疫,2002,8(1):11-13.

[5]黃芳,石偉先,盧桂蘭,等.不同類型樣本在甲型HI N1流行性感冒診斷及研究中的意義[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,44(12):1079-1082.

（本文編輯：沈昱平）

收稿日期：（2014-05-27）

基金項(xiàng)目：浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012KY13159）

作者單位：310014杭州市兒童醫(yī)院感染科（趙仕勇、林先耀、王娟、吳亦棟、祁正紅、邵啟民）；浙江大學(xué)傳染病診治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（崔大偉）

通信作者：趙仕勇，E-mail：jhzsyhj@163.com

Value of stool samples in detection of viral nucleic acid in Children with measles

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the application of stool samples in detection of nucleic acid in children with measles. MethodsThirty eight children with a clinical diagnosis of measles were admitted in Hangzhou Children's Hospital from March to June 2013.The throat swabs and stool specimens were collected within 2 days of admission.The specimens were examined with fluorescence quantitative RT-PCR for nucleic acid of measles virus.ResultsThe viral nucleic acid was positive in 37 stool specimens(97.4%)with a Ct value of 23.8±3.04 and in 35 throat swabs samples(92.1%)with a Ct value of 28.0±4.0,respectively(positive rate:χ2=0.029,P＞0.05;Ct value:t=5.23,P＜0.05).The amplified PCR products were positive in gene sequencing. ConclusionThe stool sample has the same diagnostic value as throat swab specimens in detection of measles viral nucleic acid and the former is more convenient with better compliance for collection.

【Key words】MeaslesStoolNucleic acidFluorescent quantitativnRT-PCR