張艷妮，龔甜，李健雄，施勇，徐剛

（江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029）

麻疹是一種由麻疹病毒引起,主要經(jīng)呼吸道傳播的兒童常見(jiàn)傳染病。麻疹病毒屬于副粘病毒科，麻疹病毒屬。WHO 根據(jù)麻疹病毒基因信息，將麻疹病毒分為8 個(gè)組23 個(gè)基因型別[1,2]，但是目前在全世界范圍內(nèi)流行的只有18 個(gè)基因型別[3,4]，麻疹病毒雖然基因型別眾多，但卻只有一個(gè)血清型。麻疹病毒基因組有6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因和2 個(gè)非結(jié)構(gòu)基因,而6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,其中編碼核蛋白（nucleoprotein,N）基因和血凝素蛋白（hemagglutinin,H）基因是麻疹病毒核苷酸發(fā)生變異的主要區(qū)域[5]。血凝素蛋白由1854 個(gè)核苷酸組成，編碼617個(gè)氨基酸。麻疹病毒N 基因C 末端的450 個(gè)堿基就可以對(duì)麻疹病毒的基因型別做出判定,但是麻疹病毒的中和抗原主要集中在H 基因上,為了更好的掌握江西省麻疹病毒的流行基因型及流行基因型的變異情況，有效防控麻疹的流行，本文對(duì)2013-2016 年在麻疹監(jiān)測(cè)中挑選75 株麻疹毒株進(jìn)行了血凝素（H）基因的序列測(cè)定，并與GenBank 中中國(guó)麻疹疫苗株和各基因型別的代表株進(jìn)行序列比對(duì)，分析其親緣關(guān)系、同源性等變異情況，以期可以為江西省麻疹防控策略的制定和實(shí)施提供科學(xué)有效的依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的采集 根據(jù)《全國(guó)麻疹監(jiān)測(cè)方案》的要求，對(duì)報(bào)告的疑似麻疹病例，采集出疹3d 內(nèi)的咽拭子標(biāo)本,標(biāo)本采集后保存在3ml 病毒保存運(yùn)輸液中（含5%牛血清、終濃度2000U/ml 青霉素、200μ/ml 鏈霉素和25μ/m 制霉菌素）。實(shí)驗(yàn)室在收到病原學(xué)標(biāo)本后7d 內(nèi)完成核酸檢測(cè), 對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行麻疹病毒的分離培養(yǎng)。

1.2 麻疹病毒的分離培養(yǎng) 將咽拭子標(biāo)本接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好且覆蓋率達(dá)到80%~90%的單層Vero-Slam 細(xì)胞，吸附1.5h 后棄去上清，斜面管中加入2ml 含2%牛血清的細(xì)胞維持液，放37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。麻疹病毒可以在Vero-Slam 細(xì)胞上可以出現(xiàn)特異性的細(xì)胞融合病變,當(dāng)觀察到CPE 時(shí),可收獲細(xì)胞培養(yǎng)液；對(duì)未觀察到細(xì)胞病變的樣本，連續(xù)盲傳3 代，若至第三代結(jié)束仍未觀察到CPE,則此標(biāo)本判斷為陰性。

2 病毒核酸提取、擴(kuò)增、測(cè)序

2.1 核酸提取 取病毒培養(yǎng)物200μl，使用Qiagen公司的Rneasy Mini kit 提取試劑盒提取病毒的總RNA，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

2.2 麻疹病毒的鑒定 麻疹病毒的鑒定使用碩世生物的麻疹風(fēng)疹雙通道熒光定量RT-PCR 試劑盒進(jìn)行鑒定，熒光PCR 儀為ABI7300。反應(yīng)體系及檢測(cè)程序均參考試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

2.3 擴(kuò)增麻疹病毒H 基因全長(zhǎng)及序列測(cè)定 擴(kuò)增H 基因的引物參考文獻(xiàn)[8]，擴(kuò)增體系使用QIAGEN One Step RT-PCR Kit 試劑盒進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，體系配制參考試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[9]。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

2.4 序列比對(duì)分析 使用DNAStar 和MEGA5.0 軟件對(duì)獲得的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的麻疹病毒各基因型的參考株和標(biāo)準(zhǔn)株基因序列均從GenBank 下載。各基因型參考株序列登錄號(hào)為：AF045201(CHN/93/7)、AF04 5203 (CHN/94/1)、AF045202(CHN/94/7)、AF045196(CHN/93/2)、U03663（Shanghai-191）。

3 結(jié)果

3.1 麻疹病毒分離 2013 年-2016 年江西省麻疹風(fēng)網(wǎng)絡(luò)疹實(shí)驗(yàn)室共收到麻疹病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性的咽拭子標(biāo)本260 例,對(duì)260 例標(biāo)本都進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，共分離到麻疹病毒株80 株，病毒分離率為30.77%。見(jiàn)表1。

表1 2013 年-2017 年江西省麻疹病毒分離情況

由表1 可以看出，2013 年-2016 年的病毒分離率多在30%左右，只有2014 年的病毒分離率為41.46%，略高與其他3 年。

3.2 熒光-PCR 鑒定結(jié)果 經(jīng)病毒分離培養(yǎng)共獲得80 株病毒分離株，使用碩世生物的麻疹風(fēng)疹雙通道熒光定量RT-PCR 試劑盒對(duì)其進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定，所得到的80 株病毒分離株均為麻疹病毒株。

3.3 H 基因序列結(jié)果分析 挑選75 株麻疹病毒株進(jìn)行H 基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物直接送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行分析拼接，75 株毒株均 H 基因序列的長(zhǎng)度均為 1854bp；用MAGE5.0、DNAStar5.0 軟件對(duì)得 H 基因序列進(jìn)行分析比對(duì),各分離株H 基因之間的核苷酸同源性為97.86%~100%,與疫苗株Shanghai-191 H 基因的核苷酸同源94.23%~94.71%, 與H1 基因型代表株CHN/93/7 （AF045201）H 基因的核苷酸同源性為97.69%~98.36%, 與H1a 基因型代表株CHN/93/2（AF045196）H 基因的核苷酸同源性為 98.41%-99.02%, 與 H1c 基因型代表株 CHN/94/7（AF0452 02）H 基因的核苷酸同源性為96.90%~97.58%，與H2 基因型代表株 CHN/94/1 （AF045203）H 基因的核苷酸同源性為96.44%~97.13%。

3.4 H 基因進(jìn)化樹(shù)分析 對(duì)75 株麻疹病毒分離株進(jìn)行核酸提取并擴(kuò)增H 基因，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行雙向序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后，獲得75 株麻疹病毒H 基因的序列長(zhǎng)度均為1854bp。使用DNASTAR、MAGE5.0 軟件對(duì)各個(gè)序列之間的同源性進(jìn)行序列比對(duì)分析，并做進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖1。

由圖1 可以看出，75 株分離株的 H 基因與H1a 基因型分屬于同一個(gè)分支，屬H1a 基因型。但是75 株毒株，又形成了兩個(gè)獨(dú)立的小分支，其中2013 年和2014 年的11 株毒株位于一個(gè)分支上，剩余64 株毒株則集中在另外一個(gè)分支上。由64株病毒構(gòu)成的大分支又可以分為兩個(gè)部分,分支一由 40 株毒株（2015 年和 2016 年的毒株）構(gòu)成，分支二由 24 株毒株（2013 年、2014 年和 2015 年）構(gòu)成。由此推斷，在 2013 年-2014 年，江西省可能存在兩個(gè)病毒傳播連，其中一個(gè) （11 株） 傳播鏈在2014 年以后，消失了；而另一個(gè)傳播鏈則繼續(xù)在流行傳播，這一傳播鏈中的某一優(yōu)勢(shì)毒株，漸漸取代了其他的毒株，在2015 年和2016 年成為流行株，廣泛傳播。

3.5 氨基酸同源性分析 H 基因共有1854bp,由此可以推斷氨基酸數(shù)為617，各分離株之間H 基因氨基酸的同源性為97.7%~100%，與疫苗株Shanghai-191 H 基因氨基酸同源94.50%~95.69%，與H1 基因型代表株 CHN/93/7（AF045201）H 基因的氨基酸同源性為97.04%~98.20%, 與H1a 基因型代表株CHN/93/2 （AF045196）H 基因的氨基酸同源性為98.2%~99.02%，與 H1c 基因型代表株 CHN/94/7（AF045202）H 基 因 氨基 酸 同 源 性 為 96.54%~97.7%，與 H2 基因型代表株 CHN/94/1（AF045203）H 基因氨基酸同源性為96.7%~97.87%。以shanghai-191 的H 基因氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)，分析75 株分離毒株的H 基因的氨基酸構(gòu)成存在的變異。經(jīng)分析得知，有22 個(gè)氨基酸發(fā)生了完全置換，完全置換的位點(diǎn) 18 P-S，133 L-F，149 D-N，211 G-S,240 S-N,243 R-G,279 L-F,280 V-I,303 E-G,359 A-F,364 K-N,405 N-S,420 T-A,421 V-A,423 L-P,476 F-L,481 Y-N,484 N-T,506 D-G,562 V-T,576 K-R,609 T-N； 另有19 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了部分氨基酸的置換。

圖1

4 討論

本研究分析了2013 年-2016 年江西省75 株麻疹毒株進(jìn)行的H 基因的全序列的測(cè)定，測(cè)序結(jié)果顯示，所有毒株的基因型別均為H1a 基因型，與此前施勇[6]、張艷妮[7]等人監(jiān)測(cè)的 2008-2013 年江西省麻疹毒株基因型別相同,說(shuō)明從2007 年-2016年, 麻疹病毒H1a 基因型一直是江西省優(yōu)勢(shì)基因型，這與全國(guó)的麻疹病毒監(jiān)測(cè)結(jié)果是一致的。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，H1a 基因型2013 年-2016 年麻疹病毒優(yōu)勢(shì)基因型，但是在傳播過(guò)程中，又存在不同的傳播鏈。進(jìn)化樹(shù)顯示，2013 和2014 年的毒株分部于兩個(gè)分支中, 說(shuō)明在2013 年、2014 年有兩個(gè)傳播鏈在共同傳播，一個(gè)傳播鏈在2014 年以后消失了，這可能與麻疹免疫接種策略有關(guān)，適齡兒童及時(shí)進(jìn)行麻疹疫苗的接種，阻斷了病毒的傳播途徑；另一分支中的某一毒株在流行傳播過(guò)程中,漸漸成為優(yōu)勢(shì)株，在2015 年、2016 年廣泛流行。各分離株H 基因在氨基酸和核苷酸上的變異性不大，分別為97.7%~100%和 97.86%~100%。但是與疫苗株Shanghai-191 的同源性存在一定差異,有可能是出現(xiàn)抗原漂移。75 株麻疹毒株均保留了5 個(gè)糖基化位點(diǎn)中的4 個(gè)位點(diǎn), 只是第5 個(gè)位點(diǎn)的氨基酸在240 位由S 變?yōu)镹，導(dǎo)致了麻疹病毒的一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)的缺失，與文獻(xiàn)報(bào)道[10]的中國(guó)流行的麻疹病毒的基因特點(diǎn)相一致；單元春[12]、陳國(guó)清[13]等人發(fā)表的關(guān)于麻疹病毒血凝素蛋白變異情況的研究結(jié)果與本文相同，即第五個(gè)糖基化位點(diǎn)缺失，可能導(dǎo)致麻疹病毒發(fā)生抗原漂移。H 基因上的多個(gè)氨基酸發(fā)生了置換,可能會(huì)導(dǎo)致H 蛋白的表面位點(diǎn)發(fā)生改變，使中和抗體水平下降，影響疫苗的免疫效果。

我省自2007 年至今流行的優(yōu)勢(shì)株一直是H1基因型[11,6]，但是隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人員流動(dòng)速度和規(guī)模越來(lái)越大,麻疹病毒地域性的流行特點(diǎn)有可能會(huì)被打破。近年來(lái)，全國(guó)多省份相繼發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了麻疹病毒其他基因型，如2012 年上海發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了中國(guó)首例輸入性 D8 基因型[5]； 2017 年-2019 年江蘇省發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了輸入性D8 和B3 基因型[14]；福建[15]、遼寧[16]、四川[17]等地也發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了其他的基因型。H 基因決定的H 蛋白，是麻疹病毒重要的中和抗原，更加深入的研究H 基因，進(jìn)而了解麻疹病毒的抗原是否發(fā)生改變。加強(qiáng)麻疹病毒的監(jiān)測(cè)，才有可能及時(shí)的發(fā)現(xiàn)是否有基因型別其他麻疹病毒在流行，從而為江西省的麻疹免疫策略的制定，提供有效的理論支撐。