欒國棟， 蔡 真， 李 寅

中國科學院微生物研究所，北京100101

微生物細胞性能的改造和提高是現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)的核心問題，對生物煉制和生物經(jīng)濟發(fā)展有著重要意義［1～3］。進化工程是改造微生物細胞各種復雜生理表型的主要策略和手段。盡管進化工程新理論、新技術(shù)和新工具的開發(fā)已取得了巨大的進展和成果，但是誘變篩選［4］、連續(xù)馴化［5，6］和組合工程［7］等現(xiàn)行各種技術(shù)手段仍存在著不同程度的進化效率低、對人工介入依賴性強、連續(xù)性差的問題和缺陷［8］。近年來，生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)Τ蛔兾⑸锛毎恼J識和應用為進化工程的發(fā)展指明了新的方向。通過設(shè)計開發(fā)人工可控的微生物細胞超突變系統(tǒng)，可以實現(xiàn)連續(xù)便捷的胞內(nèi)自動誘變，推動完成真正高效、連續(xù)、自動化的微生物菌株選育，極大地提高細胞性能改造的效率和效果。本文將對超突變細胞的產(chǎn)生機制、構(gòu)建策略及其在進化工程和生物技術(shù)領(lǐng)域中的應用進行概述，并探討其未來發(fā)展的可能方向。

1 進化工程

進化工程(evolutionary engineering)是一種模擬自然界進化中的變異－選擇過程，通過人工選擇實現(xiàn)微生物的定向進化，篩選獲得優(yōu)良菌株的育種技術(shù)。進化工程通過對基因組突變的選擇和積累，實現(xiàn)對細胞表型的定向改造，其應用并不依賴于對菌株遺傳背景的認識，因此特別適合對反應機制不清楚或有大量基因產(chǎn)物參與的復雜生理表型的改造［6，9］。

變異與選擇是進化的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。變異是指遺傳型的改變引發(fā)表型的改變，在特定的選擇壓力下表現(xiàn)為個體間適應性的差異;選擇是指在特定選擇壓力下對微生物細胞抑制性培養(yǎng)，造成細胞間的生存競爭，使菌群從遺傳到表型向著特定方向變化。進化工程實際操作中還包括篩選的步驟，即在菌群進化的最終階段從培養(yǎng)液中存在的不同突變體中精選出最符合需要的菌株。為了獲得具有理想表型的工業(yè)微生物菌株，通常要進行反復的“變異－選擇－篩選”流程，即以前一輪進化獲得的優(yōu)良菌株為出發(fā)菌進行下一輪進化，實現(xiàn)表型的連續(xù)改良［10，11］。

變異是進化工程的基礎(chǔ)，微生物菌群遺傳型和表型的多樣性從根本上決定最終是否能獲得性能得到提高的菌株。傳統(tǒng)進化工程技術(shù)通過連續(xù)傳代來積累基因組復制過程中的隨機突變，但是基因組復制過程中自然突變率極低［12～14］，極大地限制了進化工程的效率;為了提高基因組復制突變率，在菌株改造過程中會使用各種理化誘變劑處理細胞，引發(fā)DNA復制錯誤，加快突變產(chǎn)生，但是誘變劑的使用會對細胞造成極大傷害，而且容易使細胞對特定誘變劑產(chǎn)生抗性。近年來又出現(xiàn)了以隨機敲除和隨機過量表達、人工轉(zhuǎn)錄因子工程、全局轉(zhuǎn)錄機器工程、核糖體工程和基因組改組為代表的多種新型進化工程技術(shù)，能夠高效地擾動復雜的細胞生理與代謝網(wǎng)絡(luò)，在菌群中引入多樣性，為表型篩選提供材料［7］。但其實施過程依賴于遺傳操作，需要反復的人工操作，降低了整個進化工程的效率和連續(xù)性。

理想的進化工程技術(shù)應該同時具備過程的連續(xù)性和進化的高效性，也即需要進化體系中的微生物細胞群體能夠不依賴于人工介入就可以迅速地產(chǎn)生遺傳多樣性，并在篩選壓力下完成適應性進化。具有較高基因組復制突變率的超突變細胞可以充分滿足這一要求，并在進化工程領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應用潛力。

2 超突變細胞的產(chǎn)生與構(gòu)建

2.1 超突變細胞的產(chǎn)生機制

超突變細胞是指基因組復制突變率較高，DNA復制過程中產(chǎn)生大量隨機突變的細胞。正常情況下，微生物細胞DNA復制保真性極高，堿基突變率大約為 10－10～ 10－9/復制［12～14］。DNA復制的高度精確性保證了遺傳信息的穩(wěn)定傳遞和物種性狀的穩(wěn)定遺傳，在穩(wěn)定環(huán)境下有利于生物種群有效保持其經(jīng)過自然選擇優(yōu)化過的環(huán)境適應性［12，15］，這種高度精確性是由復雜的、多層次的保真機制來維持的，主要包括堿基選擇、3'→5'外切校正、甲基化介導DNA錯配修復(MMR)和DNA 損傷修復等［14，16，17］。DNA 聚合酶對堿基的正確選擇是復制準確性的第一道保證，也是最根本的保證，只有正確配對的堿基對(A-T/G-C)才能滿足DNA聚合反應時聚合酶生化與結(jié)構(gòu)上的要求，因此保證了整個反應的高度準確性，以大腸桿菌中最主要的DNA聚合酶DNA PolⅢ為例，其核心酶體催化反應過程中堿基錯配概率僅為10－5～10－4。而錯配一旦發(fā)生，其帶來的聚合酶復合物構(gòu)型變化會終止反應，隨即聚合酶中具有3'→5'外切酶活性的ε亞基會立即將錯誤堿基切除并重啟反應，3'→5'外切校正將DNA復制的保真性提高了2～3個數(shù)量級。MMR系統(tǒng)是相對獨立于DNA聚合過程以外的復制錯誤校正系統(tǒng)，該系統(tǒng)發(fā)揮作用通常依賴于Dam甲基化機制。當DNA復制堿基錯誤配對形成時，MMR系統(tǒng)會迅速識別配對錯誤，并根據(jù)新鏈/舊鏈Dam甲基化程度的差異，將新生鏈上由錯誤堿基開始的一段序列切除。大腸桿菌中由MutS、MutL、MutH在內(nèi)的一系列功能元件參與的MMR機制將DNA復制保真性提高了1～2個數(shù)量級。除了對DNA復制過程中發(fā)生的錯誤進行識別和校正以外，對胞內(nèi)DNA損傷的修復也起著重要的保真作用。例如，DNA雙鏈中鳥嘌呤(G)可能被氧化形成8-oxoG，并在DNA復制時與腺嘌呤(A)配對從而導致突變，糖基酶MutM能將8-oxoG切除，以保證修復后復制時發(fā)生準確的G-C配對。另一種糖基酶MutY則可以在8-oxoG-A配對形成時將A切除，使8-oxoG-C配對在短時間內(nèi)繼續(xù)保持，為MutM 修復爭取時間［16，18，19］。復雜的、層級式的保真機制保證了DNA復制過程的高度精確性，而當其中相關(guān)基因發(fā)生結(jié)構(gòu)性的、可遺傳的功能缺陷甚至失活時，就會在不同程度上影響DNA復制的保真性，影響遺傳信息的準確傳遞，形成超突變細胞。

此外，天然細胞在營養(yǎng)極度缺乏、環(huán)境壓力脅迫嚴重時，也會激發(fā)一系列全局性應激機制，造成基因組不穩(wěn)定性加強，復制突變率提高，形成暫時性的超突變狀態(tài)［20，21］。壓力應激條件誘導產(chǎn)生細胞突變機制尚未得到完全公認的解釋，其中涉及的元件或機制包括σ因子RpoS表達上調(diào)，SOS系統(tǒng)激發(fā)，Pol VI、Pol V等易錯型DNA聚合酶表達上調(diào)以及MMR系統(tǒng)表達下調(diào)等，而脅迫條件下胞內(nèi)各種造成DNA損傷的因子(例如ROS、H2O2等)的含量通常也會大量增加，進一步促進DNA復制突變率的提高［22］。

2.2 超突變細胞的人工構(gòu)建

超突變細胞較高的基因組復制突變率，可以為微生物進化提供更強的動力，因此超突變細胞在進化工程和生物技術(shù)領(lǐng)域具有得天獨厚的優(yōu)勢和潛力。但是天然超突變細胞在自然界中以非常低的比率存在著，而且存在著遺傳背景不清楚、生理表型不明確、系統(tǒng)可控性差等問題，在一定程度上限制了其有效應用。為了充分利用超突變細胞，更好的選擇是從背景清晰、表型明確的宿主菌株出發(fā)構(gòu)建人工可控的超突變細胞?，F(xiàn)階段對DNA 復制機制的充分認識［23，24］，大量增變/抑變基因的發(fā)現(xiàn)，為超突變細胞的構(gòu)建提供了大量操作靶點［16］，而各種遺傳操作的工具的出現(xiàn)和發(fā)展進一步使得對細胞突變狀態(tài)進行人工調(diào)控成為可能。

現(xiàn)階段，人工構(gòu)建超突變細胞的策略主要包括以下幾種:①通過基因敲除手段失活非生長必須型保真元件。對于以MMR系統(tǒng)中MutS、MutL為代表的非生長必需型保真元件來說，通過直接的基因敲除就可以實現(xiàn)相關(guān)機制的失活，引發(fā)DNA復制突變率的提高，并且不會影響到宿主的正常生長［25～27］;②通過遺傳修飾降低或消除生長必須型保真元件的保真活性。參與DNA復制保真機制的很多元件與DNA的復制過程直接相關(guān)，是細胞生長、復制所必須的，以大腸桿菌為例，其dnaE，dnaQ，polA等都是重要的保真元件 ，又是細胞生長的必需基因。針對此類靶標，通過解析其序列、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，對特定位點進行操作，在不影響其DNA復制功能的前提下，消除或降低其校正活性，也可以起到提高復制突變率的效果［28，29］;③通過上調(diào)表達細胞內(nèi)具有增變活性的元件或蛋白。微生物細胞中除了大量DNA復制保真元件外，還包含有部分對復制保真性有負面作用的基因，通常稱之為增變元件，例如壓力應激突變系統(tǒng)的各個組分，當在正常條件下人工上調(diào)此類基因表達時，即可使細胞進入超突變狀態(tài)［30］。

3 超突變細胞的應用

超突變細胞基因組中快速獲得并積累的隨機突變能夠制造豐富的遺傳和表型多樣性，以供性狀篩選，因此可以用于快速改造微生物細胞表型;另一方面，超突變細胞中較高的復制錯誤率，也使其成為一種便捷的DNA誘變工具，將目標基因以質(zhì)粒攜帶的形式導入超突變細胞進行復制傳代后，就可以便捷地獲得目標基因的突變體文庫。因此，超突變細胞在蛋白質(zhì)和微生物的進化工程方面有著廣泛的應用前景。

3.1 應用超突變細胞進化細胞生理表型

傳統(tǒng)進化工程技術(shù)為了改造微生物細胞底物利用能力、環(huán)境耐受性等復雜表型需要通過連續(xù)傳代的手段，經(jīng)過長期馴化，逐漸積累基因組中的隨機突變來達到改良細胞表型的目的［5，6］。為了加速進化過程，往往會使用理化誘變劑處理、轉(zhuǎn)座子誘變等手段來加速基因組范圍內(nèi)突變產(chǎn)生的速度［10，31］。超突變細胞本身具有的基因組復制高突變率的特點使其在應用于表型篩選改造時具有連續(xù)、高效的特點，無需進行人工處理，即可在子代細胞基因組上生成大量突變，進而形成表型多樣性以供篩選。

將超突變細胞應用于微生物的生理表型改造最早報道于2001年，Genencor公司的Selifonova等［32］使用外源質(zhì)粒表達大腸桿菌強增變基因mutD5，使細胞的基因組復制突變率提高了近4 000倍，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過兩輪篩選就獲得了對有機溶劑DMF的耐受濃度提高10～20 g/L的進化菌株，在DMF耐受細胞中只要將外源質(zhì)粒消除，基因組復制突變率就能回復正常，使表型得以穩(wěn)定遺傳。Zhu等［33］通過敲除大腸桿菌的mutS基因，獲得了突變率提高100倍左右的超突變菌株，經(jīng)過進化成功地提高了宿主對丁醇、NaCl以及高溫脅迫的耐受能力。Endo等［34］將枯草芽孢桿菌超突變細胞用于加速菌株的溫度適應性進化。在一株因GroEL基因替換而表現(xiàn)為熱耐受性減弱(52℃→50℃)的枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)上，通過敲除mutS、mutM和mutY基因形成了超突變細胞，經(jīng)過選擇成功地使宿主的溫度耐受性回復到了野生型的水平。Itakura等［35］通過對根瘤菌(Bradyhizobium japonicum)中編碼DNA聚合酶Ⅲ復合物ε亞基的dnaQ基因進行定點突變，使其關(guān)鍵的保守區(qū)域ExoI中重要的活性氨基酸位點Asp7和Glu9突變?yōu)锳la，成功地構(gòu)建了超突變菌株并應用于馴化，最終獲得的突變菌株表現(xiàn)出比野生型高7～12倍的N2O呼吸活性。在真核細胞中，人工構(gòu)建超突變細胞主要通過對其DNA聚合酶3(delta)進行改造。早在1993年，Morrison等［36］將釀酒酵母DNA聚合酶Pol3中負責3'→5'外切酶活性的氨基酸保守區(qū)域“Phe-Asp-Ile-Glu-Thr”進行定點突變改為“Phe-Ala-Ile-Ala-Thr”(由Pol3基因突變?yōu)镻ol3-01)，獲得的菌株突變率相比野生型提高了130倍，而正常生長未受影響，而將所獲得工程菌株中參與MMR校正的pms基因敲除時，細胞突變率甚至提高了19 000倍。類似的對DNA聚合酶2中相同保守區(qū)域進行改造時，宿主的DNA復制突變率也有了22倍的提高［37］。2006年，Shimoda等［38］從染色體上表達 Pol3-01的釀酒酵母超突變菌株出發(fā)，經(jīng)過進化獲得了能夠耐受40℃高溫脅迫的突變株。Abe等［39，40］則使用質(zhì)粒表達Pol3-01來提高釀酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(相應的同源基因氨基酸保守區(qū)域進行了與Pol3-01類似的突變)的基因組復制突變率，通過進化成功改造了酵母菌對乙醇的耐受性和藥物蛋白合成分泌的能力。2013年韓國研究人員采用類似的策略構(gòu)建了漢遜酵母(Hansenula anomala)的超突變細胞，進行全基因隨機突變，并篩選到對木糖利用能力提高的進化菌株［41］。

本實驗室針對進化工程技術(shù)對連續(xù)性和高效性的要求，設(shè)計開發(fā)了基因組復制工程輔助的連續(xù)進化技術(shù)(genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE)，以“邊突變邊篩選”為設(shè)計原則，通過向微生物細胞中導入一組進行了遺傳修飾的DNA聚合酶保真元件突變體來擾動基因組復制過程的保真性進而構(gòu)建超突變細胞。當細胞在不斷加強的選擇性壓力下培養(yǎng)時，只有不斷富集適應性突變的子代細胞才能存活并被篩選;當保真元件突變體被消除的時候，就可以獲得具備優(yōu)良、可遺傳表型的突變菌株。在E.coli細胞中，我們應用易錯PCR技術(shù)構(gòu)建了DNA聚合酶Ⅲ復合物ε亞基的dnaQ基因的突變體文庫，導入宿主細胞后在脅迫環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)，在兩個月的時間內(nèi)成功地將細胞丁醇耐受濃度由6 g/L提高到10 g/L，將0.1%濃度乙酸環(huán)境中細胞飽和濃度提高了8倍［8］。

GREACE應用過程還反映出不同性狀的改造過程中宿主傾向于富集突變強度不同的保真元件(dnaQ)突變體的趨勢，意味著微生物細胞在不同環(huán)境中的適應與進化可能偏好于不同強度的突變率，也印證了GREACE技術(shù)設(shè)計過程中對不同突變率需要進行考慮的必要性。針對基因組復制突變率控制的需要，Luan等［26］進一步在重要的工業(yè)菌株丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中提出并開發(fā)了一套可控性超突變系統(tǒng)，通過將基因組mutS/mutL敲除失活，再將由無水四環(huán)素誘導型啟動子控制的mutS/mutL操縱子通過質(zhì)粒導回細胞，成功實現(xiàn)了對梭菌細胞基因組復制突變率的人工精細調(diào)控，通過調(diào)整無水四環(huán)素的濃度，可以實現(xiàn)在本底強度到提高120倍范圍內(nèi)的變化。應用該系統(tǒng)處于超突變狀態(tài)下的梭菌細胞表現(xiàn)出明顯增強的丁醇耐受性，反映了該系統(tǒng)的應用潛力。

3.2 應用超突變細胞進行基因突變文庫構(gòu)建

定向進化技術(shù)是進化論和進化工程理論在酶工程領(lǐng)域的重要應用，該技術(shù)不需要或不依賴于對待改造蛋白的高級結(jié)構(gòu)和功能方面的認識，而主要通過構(gòu)建基因－蛋白突變體文庫并結(jié)合高通量篩選的策略來獲得酶學性質(zhì)有所改善提高或具備新的催化活性的酶蛋白突變體［42］。構(gòu)建具有豐富的遺傳多樣性的突變體文庫對定向進化技術(shù)的成功應用具有重要意義。傳統(tǒng)上，定向進化技術(shù)主要是通過易錯 PCR(error-prone PCR，EPPCR)或DNA shuffling的手段來構(gòu)建待改造蛋白的突變體文庫。近年來，超突變細胞的胞內(nèi)誘變體系在該領(lǐng)域也表現(xiàn)出巨大的應用潛力和價值。

1997年，Stratagene公司的研究人員構(gòu)建了第一個可用于構(gòu)建基因突變體文庫的大腸桿菌菌株XL1-Red。XL1-Red菌株中，3'→5'外切校正系統(tǒng)(mutD/dnaQ)、MMR系統(tǒng)(mutS)和DNA修復系統(tǒng)(mutT)的相關(guān)基因都進行了改造，其基因組復制隨機突變率比野生型大腸桿菌高5 000倍以上，使用ColE1復制起始位點的質(zhì)粒攜帶目標基因在XL1-Red菌株中傳代培養(yǎng)時，宿主僅需復制24代，就能使1 kb長度的目標基因上平均引入1個突變，而野生菌達到相同水平的突變效果需進行120 000代復制［43］。XL1-Red系統(tǒng)使用時只需將待突變建庫的目標基因插入ColE1來源的質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)入XL1-Red，根據(jù)需要的突變率，在合適的時間內(nèi)傳代培養(yǎng)細胞，然后將質(zhì)粒抽提出來就獲得了突變體文庫［43］。XL1-Red系統(tǒng)已經(jīng)成功地應用于酯酶［44，45］、葡萄糖醛酸酶［46］、芳基丙二酸脫羧酶［47］以及聚羥基脂肪酸酯合酶［48］等大量酶蛋白的定向進化，從中篩選到了活性、穩(wěn)定性、專一性等性質(zhì)有所提高的各種突變體，甚至噬菌體抗性蛋白［49］、肝炎病毒抗體［50］等特殊蛋白的進化或改造也可以使用該系統(tǒng)進行。

XL1-Red系統(tǒng)能夠有效地向外源質(zhì)粒上的DNA片段引入突變，但是理論上該系統(tǒng)對細胞內(nèi)DNA的突變是無差別的，無論是基因組DNA還是質(zhì)粒DNA都以近乎相同的強度進行突變，同時還造成了菌株細胞本身極大的不穩(wěn)定性。理想的用于蛋白質(zhì)定向進化的胞內(nèi)突變機制應該是靶向性的，可以集中對特定區(qū)域的DNA進行誘變。Loeb 等［51，52］開發(fā)了一套新的基于易錯型 DNA PolⅠ的胞內(nèi)誘變系統(tǒng)，在DNA胞內(nèi)突變的靶向性上取得了很大的進展。大腸桿菌細胞中ColE1來源的質(zhì)粒DNA復制起始是由PolⅠ來執(zhí)行的，Loeb實驗室通過對PolⅠ的突變和改造，獲得了大量增變型突變體，會引發(fā)宿主細胞基因組復制保真性的提高或降低。將保真性降低的易錯型PolⅠ編碼基因在質(zhì)粒載體(非ColEI來源)上表達，在此基礎(chǔ)上將目標基因連入ColE1質(zhì)粒并導入宿主后，就可以進行突變建庫。分析證明，使用該系統(tǒng)進行突變體文庫構(gòu)建時突變效率與目標基因的長度以及與PolⅠ結(jié)合位點的距離直接相關(guān)，為了滿足不同的建庫要求，需要有針對性地進行設(shè)計。雖然該體系尚未能實現(xiàn)完全地將突變限制在質(zhì)粒上，但是對目標基因的突變率還是比基因組DNA突變率高一個數(shù)量級以上。

4 展望

高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，對細胞DNA復制保真機制認識的不斷加深以及新型高效遺傳操作工具的不斷涌現(xiàn)，使得構(gòu)建各種特殊性質(zhì)的超突變細胞成為可能。而隨著進化工程相關(guān)領(lǐng)域理解和認識的加深，對人工構(gòu)建超突變細胞的各種性質(zhì)也有了新的要求。未來的人工可控超突變細胞發(fā)展方向是:①超突變態(tài)/正常態(tài)的便捷切換;②不同程度突變強度的精細調(diào)控;③不同DNA突變類型的平衡引入;④特定區(qū)域DNA的定向集中突變。在突變的時序、空間和強度上都具備良好人工可控性的超突變細胞將為微生物細胞和蛋白的進化提供更強更好的進化動力，有效地滿足各種性狀改善提高的需要，從而促進生物技術(shù)在不同領(lǐng)域的應用和發(fā)展。

［1］Kern A，Tilley E，Hunter I S，et al..Engineering primary metabolic pathways of industrial micro-organisms［J］.J.Biotechnol.，2007，129(1):6 －29.

［2］Patnaik R，Louie S，Gavrilovic V，et al..Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance ［J］. Nat.Biotechnol.，2002，20(7):707 －712.

［3］Alper H，Moxley J，Nevoigt E，et al..Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production［J］.Science，2006，314(5805):1565 －1568.

［4］Parekh S，VinciR V A，Strobel J.Improvement of microbial strains and fermentation processes［J］. Appl. Microbiol.Biotechnol.，2000，54(3):287 －301.

［5］Koppram R，Albers E，Olsson L.Evolutionary engineering strategies to enhance tolerance of xylose utilizing recombinant yeastto inhibitors derived from spruce biomass［J］.Biotechnol.Biofuels，2012，5(1):32.

［6］Sauer U.Evolutionary engineering of industrially important microbial phenotypes［J］.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，2001，73:129－169.

［7］Santos C N，Stephanopoulos G.Combinatorial engineering of microbes for optimizing cellular phenotype［J］.Curr.Opin.Chem.Biol.，2008，12(2):168 －176.

［8］Luan G，Cai Z，Li Y，et al..Genome replication engineering assisted continuous evolution(GREACE)to improve microbial tolerance for biofuels production［J］.Biotechnol.Biofuels，2013，6(1):137.

［9］Petri R， Schmidt-DannertC. Dealing with complexity:evolutionary engineering and genome shuffling［J］. Curr.Opin.Biotechnol.，2004，15(4):298 －304.

［10］Sonderegger M， Sauer U. Evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae for anaerobic growth on xylose［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2003，69(4):1990 －1998.

［11］Sen M，Yilmaz U，Baysal A，et al..In vivo evolutionary engineering of a boron-resistant bacterium:Bacillus boroniphilus［J］.Antonie Van Leeuwenheek.，2011，99(4):825 －835.

［12］Kimura M.On evolutionary adjustment of spontaneous mutation rates［J］.Genet.Res.，1967，9(1):23 － 34.

［13］Ishii K，Matsuda H，Iwasa Y，et al..Evolutionarily stable mutation rate in a periodically changing environment［J］.Genetics，1989，121(1):163－174.

［14］Echols H， Goodman M F.Fidelity mechanisms in DNA replication［J］.Annu.Rev.Biochem.，1991，60:477 －511.

［15］Leigh E G Jr.The evolution of mutation rates［J］.Genetics，1973，73(1):1－18.

［16］Horst J P，Wu T H，Marinus M G.Escherichia coli mutator genes［J］.Trends Microbiol.，1999，7(1):29 －36.

［17］Modrich P.Mechanisms and biological effects of mismatch repair［J］.Annu.Rev.Genetics，1991，25:229 －253.

［18］Tchou J，Kasai H，Shibutani S，et al..8-Oxoguanine(8-hydroxyguanine)DNA glycosylase and its substrate-specificity［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88(11):4690 －4694.

［19］Au K G，Clark S，Miller J H，et al..Escherichia coli mutY gene encodes an adenine glycosylase active on G-A mispairs［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86(22):8877－8881.

［20］Roth J R，Kugelberg E， Reams A B， et al.. Origin of mutations under selection:the adaptive mutation controversy［J］.Annu.Rev.Microbiol.，2006，60:477 －501.

［21］Bjedov I，Tenaillon O， Gerard B， et al.. Stress-induced mutagenesis in bacteria［J］.Science，2003，300(5624):1404－1409.

［22］Foster L.Stress-induced mutagenesis in bacteria［J］.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，2007，42(5):373 －97.

［23］Kunkel T A，Bebenek R.DNA replication fidelity［J］.Annu.Rev.Biochem.，2000，69:497－529.

［24］Kunkel T A.DNA replication fidelity［J］.J.Biol.Chem.，2004，279(17):16895－16898.

［25］Sasaki M，Yonemura Y， Kurusu Y.Genetic analysis of Bacillus subtilis mutator genes［J］.J.Gen.Appl.Microbiol.，2000，46(3):183－187.

［26］Luan G，Cai Z，Gong F，et al..Developing controllable hypermutable Clostridium cells through manipulating its methyldirected mismatch repair system［J］.Protein Cell，2013，4(11):854－862.

［27］Miller J H，F(xiàn)unchain P，Clendenin W，et al..Escherichia coli strains(ndk)lacking nudeoside diphosphate kinase are powerful mutators for base substitutions and frameshifts in mismatch-repair-deficient strains［J］.Genetics，2002，162(1):5－13.

［28］Patel H，Kawate H，Adman E，et al..A single highly mutable catalytic site amino acid is critical for DNA polymerase fidelity［J］.J.Biol.Chem.，2001，276(7):5044 －5051.

［29］Lehtinen D A，Perrino F W.Dysfunctional proofreading in the Escherichia coli DNA polymerase Ⅲ core［J］.Biochem.J.，2004，384(Pt 2):337－348.

［30］Timms A R，Bridges B A.DNA polymerase V-dependent mutator activity in an SOS-induced Escherichia coli strain with a temperature-sensitive DNA polymerase Ⅲ［J］.Mutat.Res.Fundam.Mol.Mech.Mutagen.，2002，499(1):97 －101.

［31］Cakar Z P，Seker U O，Tamerler C，et al..Evolutionary engineering of multiple-stress resistant Saccharomyces cerevisiae［J］.FEMS Yeast Res.，2005，5(6 －7):569 －578.

［32］Selifonova O，Valle F，Schellenberger V.Rapid evolution of novel traits in microorganisms［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2001，67(8):3645－3649.

［33］Zhu L，Cai Z，Zhang Y，et al..Engineering stress tolerance of Escherichia coli by stress-induced-mutagenesis(SIM)based adaptive evolution［J］.Biotechnol.J.，2014，9(1):120 －127.

［34］Endo A， SasakiM， MaruyamaA， et al.. Temperature adaptation of Bacillus subtilis by chromosomal groEL replacement［J］.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2006，70(10):2357－2362.

［35］Itakura M， Tabata K， Eda S， et al.. Generation of Bradyrhizobium japonicum mutants with increased N2O reductase activity by selection after introduction of a mutated dnaQ gene［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2008，74(23):7258－7264.

［36］Morrison A，Johnson A L，Johnston L H，et al..Pathway correcting DNA replication errors in Saccharomyces cerevisiae［J］.Embo.J.，1993，12(4):1467 －1473.

［37］Morrison A，Bell J B，Kunkel T A，et al..Eukaryotic DNA polymeraseamino acid sequence required for3'→5'exonuclease activity［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88(21):9473－9477.

［38］Shimoda C， ItadaniA， Sugino A， et al.. Isolation of thermotolerant mutants by using proofreading-deficient DNA polymerase delta as an effective mutator in Saccharomyces cerevisiae［J］.Genes Genet.Syst.，2006，81(6):391 －397.

［39］Abe H， Fujita Y， Takaoka Y， et al.. Ethanol-tolerant Saccharomyces cerevisiae strains isolated under selective conditions by over-expression of a proofreading-deficient DNA polymerase delta［J］.J.Biosci.Bioeng.，2009，108(3):199－204.

［40］Abe H，Takaoka Y，Chiba Y，et al..Development of valuable yeast strains using a novel mutagenesis technique for the effective production of therapeutic glycoproteins［J］.Glycobiology，2009，19(4):428 －436.

［41］Kim O C，Kim S Y，Hwang D H，et al..Development of a genome-wide random mutagenesis system using proofreadingdeficient DNA polymerase delta in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha［J］.J.Microbiol.Biotechnol.，2013，23(3):304－312.

［42］Farinas E T，Bulter T，Arnold F H.Directed enzyme evolution［J］.Curr.Opin.Biotechnol.，2001，12(6):545 －551.

［43］Greener A，Callahan M，Jerpseth B.An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain［J］.Mol.Biotechnol.，1997，7(2):189 －195.

［44］Bornscheuer U T，Altenbuchner J，Meyer H H. Directed evolution of an esterase for the stereoselective resolution of a key intermediate in the synthesis of epothilones［J］.Biotechnol.Bioeng.，1998，58(5):554 －559.

［45］Henke E，Bornscheuer U T.Directed evolution of an esterase from Psueudomonas fluorescens.Random mutagenesis by errorprone PCR or a mutator strain and identification of mutants showing enhanced enantioselectivity by a resorufin-based fluorescence assay［J］.Biol.Chem.，1999，380(7 － 8):1029－1033.

［46］Callanan M J，Russell W M，Klaenhammer T R.Modification of Lactobacillus beta-glucuronidase activity by random mutagenesis［J］.Gene，2007，389(2):122 － 127.

［47］Terao Y，Miyamoto K，Ohta H.Improvement of the activity of arylmalonate decarboxylase by random mutagenesis［J］.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2006，73(3):647 －653.

［48］Amara A A，Steinbuchel A，Rehm B H.In vivo evolution of the Aeromonas punctata polyhydroxyalkanoate (PHA)synthase:isolation and characterization ofmodified PHA synthases with enhanced activity ［J］. Appl. Microbiol.Biotechnol.，2002，59(4 －5):477 －482.

［49］Dai G，Dunn N W，Allison G E，et al..Improvement of plasmid encoded lactococcalbacteriophage resistance by mutator strain Epicurian coli XL1-Red［J］.Biotechnol.Lett.，2000，22(9):721－725.

［50］Coia G，Ayres A，Lilley G G，et al..Use of mutator cells as a means forincreasing production levelsofa recombinant antibody directed against Hepatitis B［J］.Gene，1997，201(1－2):203－209.

［51］Camps M，Naukkarinen J，Johnson B P，et al..Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003，100(17):9727－9732.

［52］Shinka A，Loeb L A.In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I-Ile(709)in motif a functions in base selection［J］.J.Biol.Chem.，2001，276(50):46759 －46764.