張少平， 張玉燦，2*， 張偉光， 賴正鋒， 鄭云云， 陳玉水

1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院閩臺(tái)園藝研究中心，福建漳州363005;

2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州350003;

3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福州350003

苦瓜(Momordica charantia L.)是盛夏時(shí)期長(zhǎng)江以南地區(qū)的重要蔬菜，其清爽解暑、營(yíng)養(yǎng)豐富、且含有多種人體必需的微量元素，是典型的藥食同源瓜類蔬菜［1］。近年來(lái)，苦瓜在我國(guó)的商品化種植面積逐年擴(kuò)大，已成為一種較有發(fā)展前景的經(jīng)濟(jì)作物。福建省是苦瓜的主產(chǎn)區(qū)之一，年播種面積約1.5萬(wàn)hm2。苦瓜雜種優(yōu)勢(shì)明顯，所以目前苦瓜商品化種植所需種子一般都為F1代雜交種。近年來(lái)，我國(guó)很多地方都加大了苦瓜新品種的引進(jìn)及選育，苦瓜新品種推陳出新的速度較快。因此，對(duì)育成品種進(jìn)行快速鑒定及保護(hù)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義，以往形態(tài)特征鑒別苦瓜種質(zhì)和鑒定雜交種純度具有很大的局限性，而分子標(biāo)記技術(shù)具有直觀、方便、快速及成本低等特點(diǎn)，已被越來(lái)越普遍地應(yīng)用于許多植物品種的鑒別及指紋圖譜的構(gòu)建［2～6］。苦瓜品種的分子鑒別也有一些報(bào)道［7～10］。本研究以苦瓜雜交種如玉11號(hào)及其親本為材料，采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)及相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence—related amplified polymorphism，SRAP)兩種分子標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)前期引物篩選及反復(fù)驗(yàn)證，建立了如玉11號(hào)苦瓜F1代雜交種純度分子鑒定的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦瓜雜交種為如玉11號(hào)(審定編號(hào):閩認(rèn)菜2010002)，母本BAL-22-31是由日本“群星”苦瓜經(jīng)過(guò)多代自交純化而成的自交系，父本9208B是由福建漳平“西園”苦瓜經(jīng)多代純化而成的自交系，上述材料均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所提供。Taq酶、dNTPs、瓊脂糖以及合成RAPD引物及SRAP引物等均購(gòu)自生工(上海)生物技術(shù)有限公司;其他常規(guī)試劑均購(gòu)自漳州市翠林化玻儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1 2.1 不同苦瓜基因組DNA的提取 以上述三種苦瓜幼苗嫩葉作為試驗(yàn)材料，采用改良的CTAB法［11］提取其總DNA，用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm下測(cè)定其OD值，檢測(cè)DNA的濃度及質(zhì)量，并稀釋至30 ng/μL左右，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD及SRAP多態(tài)性引物設(shè)計(jì)與篩選根據(jù)目前在苦瓜上已報(bào)道的46個(gè)有效RAPD引物設(shè)計(jì)合成 RAPD 引物［12～16］(見(jiàn)表1);根據(jù)SPAP引物設(shè)計(jì)原理合成22條引物，隨機(jī)組合成121對(duì)SRAP引物(見(jiàn)表2)。使用上述3種苦瓜的混合DNA對(duì)121對(duì)引物進(jìn)行預(yù)篩選，篩選背景和擴(kuò)增條帶都比較清晰的SRAP引物。使用全部121對(duì)SRAP引物和46個(gè)RAPD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析差異條帶，篩選出現(xiàn)差異條帶的引物。對(duì)篩選到的出現(xiàn)特異條帶的RAPD及SRAP引物，再次進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證(重復(fù)提取3次DNA，以其為模板進(jìn)行5次RAPD-PCR和SRAPPCR重復(fù)實(shí)驗(yàn))，以獲得穩(wěn)定重復(fù)差異條帶的RAPD及SRAP引物。

表1 本研究中應(yīng)用的46個(gè)RAPD引物Table 1 46 RAPD primers used in this study.

表2 本研究應(yīng)用的121對(duì)SRAP引物序列Table 2 121 SRAP primers used in this study.

1.2.3 RAPD及 SRAP擴(kuò)增 RAPD及 SRAP擴(kuò)增反應(yīng)均在PCR儀上完成。RAPD-PCR反應(yīng)體系(20 μL)為:Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTPs(2.5mmol/L)1.6 μL，DNA模板 0.5 μL，擴(kuò)增引物(10 μmmol/L)4 μL，加ddH2O至20 μL。RAPD擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 3min;94℃ 1min，36℃ 1min，72℃ 2min，45 個(gè)循環(huán);72℃ 5min。于4℃保存或直接電泳檢測(cè)。SRAPPCR 反應(yīng)體系(20 μL)為:Taq DNA 酶(5 U/μL)0.2 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTPs(2.5mmol/L)1.6 μL，DNA 模板 0.5 μL，10 μmmol/L 的上下游引物各 4 μL，加 ddH2O 至 20 μL。SRAP 擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 3min;94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，5 個(gè)循環(huán);94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán);72℃ 10min。于4℃保存或直接電泳檢測(cè)。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 所得RAPD-PCR及SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物每管加入約3 μL 6 ×PCR loading buffer，其中 RAPD-PCR 產(chǎn)物用1.5%、SRAP-PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，電壓為8 V/cm，電泳1.5 h后EB染色，紫外燈下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種苦瓜基因組DNA提取結(jié)果分析

本試驗(yàn)采用改良的CTAB法提取如玉11號(hào)及其親本苦瓜新鮮嫩葉片總DNA，通過(guò)測(cè)定其OD值及檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)該3種苦瓜DNA提取的含量均較高，且總DNA中多酚類化合物及多糖等污染物均去除的較為干凈，DNA完整性也較好(見(jiàn)圖1)，適于下一步RAPD及SRAP多態(tài)性分析。

圖1 三種苦瓜總DNA提取電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genome DNA of 3 bitter gourds.

2.2 RAPD多態(tài)性引物篩選

采用已報(bào)道的46個(gè)RAPD引物對(duì)苦瓜F1代雜交種及其親本基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，46對(duì)RAPD引物均未獲得如玉11號(hào)苦瓜雜交種及其親本共顯性條帶，也未獲得父本特異標(biāo)記引物，僅1個(gè)引物R5產(chǎn)生了母本特異標(biāo)記條帶(見(jiàn)圖2)。利用R5引物可以區(qū)分如玉11苦瓜雜交種與其母本種子。

圖2 引物R5擴(kuò)增圖譜Fig.2 RAPD-PCR results using primer R5.

2.3 SRAP多態(tài)性引物篩選

采用121對(duì)SRAP引物進(jìn)行如玉11苦瓜及其親本混合DNA預(yù)篩選擴(kuò)增，其中20對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果背景清晰、條帶數(shù)量少且清楚，編號(hào)分別為:Me1-Em1、Me1-Em4、Me1-Em9、Me2-Em4、Me2-Em5、Me2-Em8、Me3-Em2、Me3-Em8、Me4-Em9、Me4-Em10、Me5-Em4、Me5-Em5、Me5-Em9、Me6-Em1、Me6-Em2、Me6-Em10、Me7-Em1、Me7-Em8、Me7-Em9和Me8-Em10，利用這20對(duì)引物進(jìn)行3種苦瓜差異片段擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這20對(duì)SRAP引物在3種不同苦瓜中擴(kuò)增出完全相同的條帶。因此重新利用其余的101對(duì)引物再次進(jìn)行SRAP擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1對(duì)引物(編號(hào)Me1-Em6)產(chǎn)生了母本特異標(biāo)記(見(jiàn)圖3)。

圖3 引物Me1－Em6擴(kuò)增圖譜Fig.3 SRAP-PCR results using primer Me1-Em6.

2.4 如玉11號(hào)苦瓜雜交種子純度的檢測(cè)

挑選190粒如玉11號(hào)F1代種子及10粒其母本種子，標(biāo)記后同時(shí)播種于穴盤(pán)育苗，待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，每株分別采取半片葉按1.2.1方法提取DNA，分別用RAPD技術(shù)(引物R5)及SRAP技術(shù)(引物Me1-Em6)進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAPD-PCR(見(jiàn)圖4)及 SRAP-PCR(見(jiàn)圖5)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后條帶結(jié)果與前期篩選的結(jié)果完全吻合，且重復(fù)性好。其中7號(hào)和11號(hào)種子出現(xiàn)母本特異條帶，鑒定為假雜交種，兩種技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明應(yīng)用上述引物，RAPD和SRAP技術(shù)都可用于識(shí)別由苦瓜母本植株自花授粉而產(chǎn)生的假雜交種。

圖4 RAPD-PCR檢測(cè)種子純度Fig.4 Seed purity identification by RAPD-PCR.

圖5 SRAP-PCR檢測(cè)種子純度Fig.5 Seed purity identification by SRAP-PCR.

3 討論

雜交種子純度的分子鑒定一般采用一對(duì)雙親互補(bǔ)型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或者采用偏父及偏母型引物組合的交叉驗(yàn)證法［3，11］。然而本試驗(yàn)同時(shí)采用RAPD和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行如玉11號(hào)苦瓜及其親本PCR擴(kuò)增時(shí)，均只擴(kuò)增出由一組引物產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記。理論上，該母本特異標(biāo)記不能直接運(yùn)用于苦瓜如玉11號(hào)種子純度的鑒定，然而在苦瓜雜交育種的實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)用中，在辨別該雜交種是否由其父母本雜交而來(lái)時(shí)，最容易發(fā)生混雜的假雜交種子是來(lái)自于母本植株的自花授粉，而本試驗(yàn)RAPD及SRAP結(jié)果均獲得一個(gè)母本特異型標(biāo)記引物，這對(duì)苦瓜如玉11號(hào)種子純度的分子鑒定具有非?，F(xiàn)實(shí)的意義。

RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般采用瓊脂糖凝膠介質(zhì)進(jìn)行分離，而SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可采用瓊脂糖凝膠及聚丙烯酰胺凝膠兩種不同介質(zhì)進(jìn)行分離。一般來(lái)說(shuō)，聚丙烯酰胺凝膠電泳操作過(guò)程更為繁瑣，且其顯示出的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增條帶繁多且復(fù)雜，這將給種子純度鑒定帶來(lái)很多不便。而瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物操作簡(jiǎn)單、特異性條帶清晰、實(shí)際操作過(guò)程中易于辨別，因此本試驗(yàn)采用了瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，RAPD-PCR試驗(yàn)結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳背景條帶較SRAPPCR試驗(yàn)結(jié)果更清楚，說(shuō)明這與DNA模板質(zhì)量無(wú)關(guān)，可能是因?yàn)镸e1-Em6引物特異性不是很強(qiáng)，但該引物檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性均很好，因此不影響如玉11號(hào)苦瓜種子純度的SRAP分子檢測(cè)。

本研究根據(jù)近年來(lái)在苦瓜上報(bào)道有效的RAPD引物共計(jì)46個(gè)，以及根據(jù)SRAP引物設(shè)計(jì)原理，隨機(jī)設(shè)計(jì)121對(duì)引物，進(jìn)行如玉11號(hào)苦瓜及其父母本差異基因篩選。從大量的試驗(yàn)操作過(guò)程看，RAPD分子標(biāo)記只需1個(gè)引物，因此操作起來(lái)較SRAP分子標(biāo)記相對(duì)簡(jiǎn)單，但在引物設(shè)計(jì)方面，因SRAP引物是兩兩配對(duì)而來(lái)，所以只需設(shè)計(jì)較少的引物就可以形成較多引物對(duì)進(jìn)行篩選試驗(yàn)，同時(shí)，RAPD分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)較SRAP分子標(biāo)記更早，其應(yīng)用于苦瓜遺傳多用性分析及種子純度鑒定等較SRAP更多，因此在苦瓜上開(kāi)發(fā)的較多的RAPD分子標(biāo)記引物，理論上可借鑒并用于如玉11號(hào)等苦瓜種子的純度鑒定，然而本試驗(yàn)表明，其他苦瓜上已開(kāi)發(fā)的RAPD標(biāo)記引物對(duì)如玉11號(hào)苦瓜種子純度鑒定參考價(jià)值不高，此兩種分子標(biāo)記結(jié)果也都只獲得一個(gè)母本特異標(biāo)記引物，說(shuō)明如玉11號(hào)苦瓜F1代雜交種與其親本(尤其是父本)基因組DNA序列相似程度極高，這與張少平等［7］對(duì)新翠苦瓜種子純度的RAPD分子檢測(cè)結(jié)果相吻合，也符合劉愛(ài)群等［17］對(duì)分子標(biāo)記鑒定葫蘆科瓜類作物種子純度的研究進(jìn)展所做的總結(jié)。因此，此結(jié)果進(jìn)一步表明，要完全通過(guò)分子手段鑒定出如玉11號(hào)苦瓜F1代雜交種純度及對(duì)其新品種保護(hù)，除了需要選擇合適的分子標(biāo)記外，還需要設(shè)計(jì)足夠多的引物，只有這樣才有可能獲得有效且最佳的雙親互補(bǔ)型引物來(lái)建立苦瓜雜交種種子的分子水平質(zhì)量控制系統(tǒng)。

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