周 艷， 張 濤， 鄭勤琴， 楊承霖， 樊皓月

天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384

連翹(Forsythia suspensa)是中國傳統(tǒng)中藥之一，又名連殼、黃花條、青翹、老翹、黃奇丹等，屬木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)［1］。連翹藥理作用十分的廣泛，是許多中藥制劑的主要原料。在臨床診療中具有抗菌、強心、利尿、鎮(zhèn)吐等作用，果實、葉片均可入藥。連翹提取液在體外有抗菌作用，可抑制葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白喉桿菌、痢疾桿菌及鏈球菌等多種革蘭陽性及陰性細(xì)菌［2～4］。

奶牛乳房炎(mastitis)又稱為乳腺炎，是由于奶牛的乳腺受到微生物因素、物理因素、化學(xué)因素、環(huán)境因素等因素刺激從而產(chǎn)生的一類炎癥反應(yīng)。在病因?qū)W研究方面，多數(shù)專家認(rèn)為奶牛乳房炎是多病因引起的一種疾病，原發(fā)和繼發(fā)細(xì)菌感染是主要病因之一［5～8］。引起奶牛乳房炎的主要致病菌包括:金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、化膿棒狀桿菌、大腸桿菌類等［9］。次要病原菌包括凝固酶陰性葡萄球菌、牛棒狀桿菌、表皮葡萄球菌、微球菌等［10，11］。

奶牛乳房炎對動物性食品安全與畜牧行業(yè)的發(fā)展造成了巨大的安全隱患，全球每年因乳房炎造成的損失約為350億美元，而我國因乳房炎帶來的經(jīng)濟(jì)損失遠(yuǎn)高于世界水平［5］。造成的損失主要包括:產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)低劣，牛奶廢棄，由治療、罰款、淘汰牛和丟失遺傳種質(zhì)等導(dǎo)致的費用支出。同時，乳房炎病牛乳汁中的大量病原微生物及其產(chǎn)生的毒素或經(jīng)治療后產(chǎn)生的大量抗生素殘留，可直接危害人類健康，奶牛乳房炎已成為制約鮮奶加工龍頭企業(yè)發(fā)展的突出問題。近幾十年來，抗生素在防治奶牛乳房炎方面發(fā)揮了重要作用，但隨著人們對食品安全要求的不斷提高和國家對乳制品質(zhì)量更嚴(yán)格的要求，臨床治療乳房炎常用的抗生素由于存在藥物殘留將逐漸被限用或禁用。并且致病菌對抗生素產(chǎn)生了抗藥性和耐藥性［7，12］，也是治療工作的重大障礙。

鑒于抗生素類化學(xué)合成藥物存在誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的弊端以及抗生素殘留引發(fā)的食品安全問題，中草藥天然抗菌制劑因其含有多種生物有效成分，不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性、低毒、低殘留或無殘留，還可以提供微量元素等特點［13～18］，已日益為國內(nèi)外專家所關(guān)注。應(yīng)用中藥治療奶牛乳房炎，連翹是其中的代表之一［2］。

本研究結(jié)合天津本地植物資源情況，從本地草藥資源中選取連翹，提取浸提物，對本地牛場中乳房炎牛乳液中分離、純化、復(fù)壯后得到的幾種致病菌，進(jìn)行抑制試驗，為奶牛乳房炎的治療提供中草藥抑制奶牛乳房炎致病菌方面的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

連翹葉片于2014年4月采自天津農(nóng)學(xué)院園藝苗圃內(nèi)，保存于本實驗室4℃冰箱中。

罹患乳房炎奶牛乳樣采集:乳樣主要采自某奶牛場3個牛群，共采集40個樣本，所選牛只均有明顯癥狀。牛只按常規(guī)擠奶消毒后，再用酒精棉球消毒乳頭和采樣者手指。每個乳頭擠去頭2～3滴，取乳后無菌乳樣約5mL，盛于滅菌青霉素瓶內(nèi)貼好標(biāo)簽，便攜冰盒保存，并于4 h內(nèi)置4℃冰箱存放。

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，固體培養(yǎng)基加瓊脂 20 g/L，pH 6.4。121℃，滅菌 15min。

真菌培養(yǎng)基:牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂 20 g/L，121℃，滅菌 20min。

1.3 主要試劑與儀器

連翹苷標(biāo)準(zhǔn)對照品(新鄉(xiāng)博凱生物技術(shù)有限公司);十八烷基硅烷鍵合硅膠(歐瑞SA-3，天津歐瑞生物科技有限公司);高效液相色譜儀(Laballiance WA2002SF，美國 Laballiance公司)。

1.4 連翹葉片有效成分的提取

取25 g葉片，冰浴研缽研磨成粉末備用。對連翹葉片粉末進(jìn)行有效成分提取，步驟如下:

①取連翹葉片粉末1 g，加70%乙醇10mL熱浸，浸出液蒸干。殘渣以1mL冰醋酸溶解后，傾入小試管，沿管壁加人硫酸1mL，兩液層間出現(xiàn)紫紅色環(huán)。②取紫紅色液層，加乙醚5mL，振搖5min，濾過，濾液置小試管中，加7%鹽酸羥胺甲醇溶液3滴，20%KOH-甲醇溶液3滴，于水浴中微熱2min，放冷，加1%HCl，使呈微酸性，再加1%FeCl3-乙醇溶液2滴，呈紫紅色。取該紫紅色液層蒸干，殘渣留存。多次操作獲得足量殘渣。③稱取殘渣約1 g，在錐形瓶內(nèi)加甲醇15mL，塞嚴(yán)防止揮發(fā)。浸提24 h，超聲25min，冷卻，稱重，加甲醇溶劑補充至原初重量，混勻，過濾，量取過濾液5mL，蒸發(fā)至近干，中性氧化鋁0.5 g拌勻，通過中性氧化鋁柱(100～120目，內(nèi)徑1～1.5cm，1 g)，加80mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸發(fā)至全干，通過這種回流熱浸提法，多次操作獲取連翹葉片提取物粉末，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 連翹葉片提取液有效成分的測定

1.5.1 薄層色譜測定 取連翹葉片提取物粉末3 g，加水20mL，煎煮 30min，加 6 mol/L HCl，調(diào)pH至2.0，即用乙醚20mL提取，回收乙醚提取后的殘渣，再溶于乙醇0.5mL中，作為待測樣品溶液。另取連翹苷標(biāo)準(zhǔn)對照品配制成參照標(biāo)樣溶液。吸取上述兩種溶液，分別點于同一硅膠H1%CMC薄層板上，以氯仿－甲醇(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%H2SO4，110℃烤10min。

1.5.2 高效液相色譜法測定 色譜條件:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:乙腈 －水(25∶75);流速:1.2mL/min:檢測波長:277 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。參照標(biāo)準(zhǔn)樣品為連翹苷標(biāo)準(zhǔn)對照品，以甲醇梯度稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6 奶牛乳房炎致病菌的獲得

將乳樣分別劃線接種于細(xì)菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基，置37℃溫箱培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征，提取典型菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢。根據(jù)菌體形態(tài)及染色特性初步判定細(xì)菌類屬，并將其進(jìn)一步純化培養(yǎng)［6，19］。

1.7 梯度濃度的連翹提取物溶液抑菌試驗

1.7.1 梯度濃度連翹提取物溶液的制備 稱取按1.4中方法得到的連翹葉片提取物，以甲醇為溶劑，制成濃度為 0.002 g/L、0.02 g/L、0.2 g/L的溶液。

1.7.2 抑菌試驗 多種致病菌4℃保存，對致病菌進(jìn)行復(fù)壯、培養(yǎng)，菌株培養(yǎng)24 h，形成菌苔。分別按1.7.1中的濃度梯度進(jìn)行連翹提取物抑菌效果試驗。以溶劑甲醇為空白對照。觀察48 h內(nèi)提取物溶液對菌苔的抑制效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹有效成分的提取與純度測定

對連翹葉片采用回流法工藝，采用不同的有機溶劑進(jìn)行浸提。薄層色譜分析結(jié)果，待測樣品在與參照標(biāo)樣色譜條帶相應(yīng)的位置上，顯示相同的灰黑色斑點(見圖1)，表明本實驗所用方法提取物質(zhì)為連翹苷。

高效液相色譜法測定結(jié)果顯示連翹葉片粉末提取物有效成分主要為連翹苷，連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品在同樣色譜條件下測定以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示在0.157～1.57 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)。測得連翹葉片粉末提取物中連翹苷的含量為0.13%，獲得較好的提取純度。

圖1 連翹提取物成分薄層色譜分析圖Fig.1 TLC analysis on the component of Forsythia suspensa extract.

2.2 奶牛乳房炎致病菌的分離、鑒定

采用劃線法、單株菌落培養(yǎng)分離奶牛乳房炎致病菌，鑒定后發(fā)現(xiàn)多數(shù)致病菌為細(xì)菌，主要是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌。真菌為曲霉。

2.3 抑菌效果

梯度濃度的連翹葉片提取物溶液對菌苔均有不同程度的抑制效果(見圖2，彩圖見封三圖版)。0.02 g/L(標(biāo)記為“Z”)的提取液出現(xiàn)了明顯的抑菌斑，抑菌斑半徑較大，觀察結(jié)束(48 h)后仍有繼續(xù)擴(kuò)大的趨勢。濃度0.2 g/L(標(biāo)記為“G”)、0.002 g/L(標(biāo)記為“D”)的連翹提取液的抑菌作用并不顯著，0.2 g/L提取液表現(xiàn)為形成的抑菌斑深而小，邊緣清晰，無擴(kuò)散趨勢，但是抑菌斑外殘留了較寬的菌環(huán)。0.002 g/L提取液形成的抑菌斑較淺，邊緣不明顯。對于金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌，抑菌圈的邊緣比較清晰，抑菌圈深度較深，在觀察結(jié)束(48 h)后有持續(xù)擴(kuò)大趨勢，對于枯草桿菌，抑菌圈邊緣比較模糊，深度較淺，觀察接近結(jié)束已經(jīng)無擴(kuò)大的趨勢，并且已經(jīng)開始變淺。可見，連翹提取液能夠抑制牛乳房炎致病菌，不同濃度的連翹提取液對供試致病菌樣本具有不同程度的抑制作用，并非濃度越高抑菌效果越好;對于不同致病菌的抑制效果也不盡相同。

圖2 梯度濃度連翹提取物溶液抑菌效果Fig.2 Bacterium inhibitory effect of Forsythia suspensa extract solution with different concentration.

3 討論

奶牛乳房炎是多因素綜合造成的危害奶牛業(yè)的常見疾病之一，也是一個世界性奶牛業(yè)問題，雖然治療方法眾多［20，21］，但仍未有一種方法能夠?qū)θ榉垦姿幍讲〕?。中藥制劑在此方面有顯著優(yōu)勢［22］，亟待開發(fā)利用。我國盛產(chǎn)連翹，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，還需結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，以加快奶牛乳房炎的致病機理與防治的研究。連翹濃縮煎劑在體外有抗菌作用，可抑制傷寒桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌等，提示連翹抗菌有效成分提取可采用熱浸法。連翹的化學(xué)成分復(fù)雜，生物活性多樣，而連翹葉化學(xué)成分和藥理作用研究還比較少，相對而言，其主要有效成分連翹苷類物質(zhì)研究較多。本研究采用熱浸回流法提取連翹有效成分，鑒定獲得有效成分連翹苷，并測定其連翹苷含量確定提取物純度，以明確連翹提取物對奶牛乳房炎病原菌的抑制作用。無論臨床型還是隱性奶牛乳房炎［23，24］，其在臨床表現(xiàn)癥狀都是炎性反應(yīng)。炎癥是乳腺損傷和產(chǎn)奶量下降的直接原因［25］。中藥能夠直接作用于病原微生物，抑制其生長繁殖或殺滅病原微生物，從而達(dá)到緩解臨床癥狀、防治疾病的目的［9］。所以在研究中藥治療奶牛乳房炎的機理時，中藥制劑的抗菌活性是一項重要的指標(biāo)［9，26］。采用連翹提取液對引起奶牛乳房炎的致病菌進(jìn)行敏感性試驗，驗證了中藥連翹的抑菌抗炎作用，為其治療奶牛乳房炎提供了有力的依據(jù)。

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