李培玉， 張 銳， 孫國(guó)清， 馬 林， 薛計(jì)雄， 林 芹， 郭三堆

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程，北京100081;

2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052

油菜是我國(guó)重要的油料作物和蛋白質(zhì)飼料作物，也是食用植物油的主要來(lái)源之一。我國(guó)油菜種植面積以及總產(chǎn)量占世界的三分之一，是世界上最大的油菜產(chǎn)區(qū)［1］。但我國(guó)油菜產(chǎn)區(qū)降水量較大，經(jīng)常會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的澇害［2，3］。澇害嚴(yán)重影響了我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此提高油菜的耐澇能力對(duì)于我國(guó)油菜可持續(xù)發(fā)展具有非常重大的意義。

澇害的本質(zhì)并不是植株體內(nèi)水分的不斷積累增加，而是長(zhǎng)時(shí)間缺氧使根系功能減弱導(dǎo)致植物代謝途徑的改變，并產(chǎn)生許多有害物質(zhì)，如二氧化碳、硫化物等，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，隨著危害程度的增加造成嚴(yán)重的傷害和減產(chǎn)［4～6］。而且由于缺氧造成作物根系損傷，植株在澇害解除以后也很難恢復(fù)生長(zhǎng)，具有明顯的滯后效應(yīng)［7］。因此，如何提高油菜抗?jié)澈δ芰κ钱?dāng)前制約油菜可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。

當(dāng)前，改良作物的耐澇能力主要是提高其無(wú)氧生活環(huán)境的適應(yīng)能力。Quimio等［8］在水稻漬水脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，厭氧環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)DC酶活性和乙醇的合成率減少了50%。在漬水脅迫過(guò)程中，通過(guò)限制酶活性的提高從而加快了代謝過(guò)程，進(jìn)而提高了終產(chǎn)物乙醇的合成。一些轉(zhuǎn)錄因子也與作物耐漬性相關(guān)，但目前為止，只在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子AtMYB2［9］。

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla haemoglobin，VHb)是研究比較成熟的一種加氧蛋白(Vgb)。最初由Khosla等［10］從透明顫菌中克隆得到，并在大腸桿菌和酵母中表達(dá)，可以加強(qiáng)細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度，降低細(xì)胞的臨界氧濃度，提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，使細(xì)胞在低氧甚至無(wú)氧條件下仍能保持生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［11～13］。已有將vgb基因引入植物細(xì)胞的研究，實(shí)驗(yàn)證明該基因也可使轉(zhuǎn)基因植物發(fā)芽提前，并加快植物的生長(zhǎng)，這可能與該基因可以增加細(xì)胞中的氧濃度相關(guān)［14］。

本研究首次通過(guò)基因工程手段將透明顫菌血紅蛋白基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)入油菜，驗(yàn)證其在油菜增產(chǎn)和抗?jié)撤矫娴墓δ芎妥饔?，為vgb基因在油菜中的表達(dá)所產(chǎn)生的生物量和生理代謝變化提供了數(shù)據(jù)，為農(nóng)作物抗?jié)逞芯刻峁┝死碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本研究田間試驗(yàn)于2010－2011年在湖北麻城進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜中雙10號(hào)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌菌株E.coli TOP10、質(zhì)粒pBI121，由本實(shí)驗(yàn)室保存。其他質(zhì)粒均購(gòu)自Promega公司。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

用PstⅠ和 XhoⅠ雙酶切 pGSKA質(zhì)粒和pG4ASVHB質(zhì)粒，得到pGSKA載體(4 kb)和vgb(452 bp)基因片段，經(jīng)過(guò)回收、連接，鑒定后得到中間載體pGSVKA。EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切中間載體pGSVKA，回收表達(dá)盒基因片段，克隆于pBI121質(zhì)粒中，并命名為pGBISVKA(見(jiàn)圖1)。

在油菜盛花期將已經(jīng)授粉的花朵摘去，采用直接噴花法或蘸花法轉(zhuǎn)化油菜花朵，轉(zhuǎn)化后的花朵做好標(biāo)記。

1.4 卡那霉素檢測(cè)

圖1 pGBISVKA質(zhì)粒載體圖譜Fig.1 Map of pGBISVKA plasmid vector.

選擇晴朗、無(wú)風(fēng)天氣的午后，配制2 000 mg/L的卡那霉素溶液，取脫脂棉浸入卡那霉素的溶液，然后貼附在油菜葉片的表面，或用噴壺將卡那霉素溶液均勻噴灑在油菜葉片表面，一周后觀察試驗(yàn)結(jié)果?？敲顾孛舾兄仓甑娜~片在接觸卡那霉素處呈黃色，不敏感植株的葉片無(wú)變化。

1.5 PCR 檢測(cè)

按照J(rèn)oobeur等［15］的方法提取油菜基因組。根據(jù)vgb基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物:vgbF:5'-ggctgcaggcttgatcaacagac-3'和 vgbR:5'-agctcgagctcaacagcttgagcgtac-3'。以轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系50 μL:1 μL基因組 DNA，5 μL 10 × PCR buffer，5 μL dNTPs，1 μL vgbF(10 μmol/L)，1 μL vgbR(10 μmol/L)，0.5 μL Taq 酶(2.5 U/μL)，ddH2O 38.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 5min;95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2.5min，35 個(gè)循環(huán);72℃ 5min。4℃，保存。電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.6 Southern 雜交檢測(cè)

Southern雜交檢測(cè)采用地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記探針，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)［16］。

1.7 耐澇性檢測(cè)

油菜的淹水試驗(yàn)在經(jīng)人工處理的不滲漏的淹水池進(jìn)行。普通田地向下挖40～45cm，鋪設(shè)防水塑料布，然后用土填平，旁邊起埂，施肥后人工播種，在油菜花期進(jìn)行為期15 d的淹水實(shí)驗(yàn)，每天下午6點(diǎn)人工往淹水池里灌水，水面保持在油菜根部4～5cm處。淹水結(jié)束后從轉(zhuǎn)基因株系中挑選出生長(zhǎng)狀況基本一致的15個(gè)株系進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定［17，18］，包括丙二醛、脯氨酸和超氧化物歧化酶的測(cè)定，進(jìn)行3次重復(fù)。然后拔出，洗凈，比較在淹澇條件下根部的形態(tài)變化。試驗(yàn)采用三重復(fù)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素篩選

在油菜的苗期用卡那霉素篩選，先采用大面積噴灑卡那霉素溶液進(jìn)行初篩，然后將不變色的油菜用脫脂棉浸泡卡那霉素溶液后，貼在油菜葉片表面，最終獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株11株。

2.2 PCR 鑒定

提取轉(zhuǎn)基因油菜葉片的基因組DNA，以稀釋10倍的基因組為模板，以vgbF和vgbR為引物，以非轉(zhuǎn)基因油菜為對(duì)照，以pGBISVKA質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行 PCR，轉(zhuǎn)基因植株樣品擴(kuò)增出約450 bp條帶，與預(yù)期的長(zhǎng)度完全一致，而陰性對(duì)照材料(中雙10號(hào))PCR擴(kuò)增結(jié)果未出現(xiàn)相應(yīng)的電泳圖譜，如圖2所示。

圖2 PCR鑒定轉(zhuǎn)vgb基因油菜植株Fig.2 PCR identification of vgb transgenic plants.

2.3 Southern 雜交分析

為了檢測(cè)外源基因在油菜基因組中的整合情況，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA進(jìn)行EcoRⅠ單酶切，以vgb基因標(biāo)記探針開(kāi)展Southern雜交，結(jié)果見(jiàn)圖3。Southern雜交結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系中出現(xiàn)了兩條明顯雜交條帶，表明所檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因油菜是雙拷貝整合。

圖3 轉(zhuǎn)vgb基因植株的Southern blot分析Fig.3 Southern blot detection of vgb transgenic plants.

2.4 轉(zhuǎn)基因油菜耐澇性分析

2.4.1 澇漬脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)vgb基因油菜脯氨酸含量的影響 在正常供水條件下(見(jiàn)圖4)，轉(zhuǎn)基因油菜和對(duì)照植株葉片脯氨酸含量較為正常，各材料之間脯氨酸含量差異不顯著。但是在淹水條件下，各材料的脯氨酸含量均出現(xiàn)不同程度的變化，非轉(zhuǎn)基因植株11～15在其淹水前后變化很明顯，脯氨酸含量較高，而轉(zhuǎn)基因植株1～10變化不明顯。說(shuō)明轉(zhuǎn)vgb基因的油菜在淹水過(guò)程中已經(jīng)基本適應(yīng)了淹水的環(huán)境，已不需要脯氨酸的調(diào)節(jié)，但對(duì)照油菜則受到淹水的危害很?chē)?yán)重，且很難恢復(fù)正常水平。

2.4.2 淹澇脅迫處理下對(duì)油菜SOD活力的影響對(duì)油菜進(jìn)行為期15 d的淹澇實(shí)驗(yàn)，采集樣品測(cè)定SOD酶活，結(jié)果如圖5所示。在正常供水條件下，轉(zhuǎn)基因油菜和對(duì)照SOD酶活的差異不明顯。而在淹水條件下，測(cè)得轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活性雖然有所降低，但與正常供水情況差距并不明顯，而對(duì)照植株的 SOD酶活性顯著下降，約50%的降幅。與對(duì)照相比，淹水條件下，轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活保持相對(duì)穩(wěn)定。而SOD酶活性的急劇變化，暗示著產(chǎn)生的SOD不能夠完全清除氧自由基，積累的氧自由基可能會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生損害，造成損失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的轉(zhuǎn)vgb基因油菜的SOD酶活性受淹水影響較小，說(shuō)明植株已經(jīng)適應(yīng)了淹澇環(huán)境，并且SOD的合成已經(jīng)逐漸恢復(fù)，這有利于油菜的體內(nèi)的自由基的清除，使損失降低。

圖4 脯氨酸的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照間的區(qū)別Fig.4 Differences of proline contents between transgenic lines and the control.

圖5 SOD的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照間的區(qū)別Fig.5 Differences of SOD contents between transgenic lines and the control.

2.4.3 油菜淹澇脅迫下對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜丙二醛含量的影響 在干旱、水澇等條件下，植物體內(nèi)常發(fā)生質(zhì)膜過(guò)氧化作用，破壞膜系統(tǒng)，導(dǎo)致植物受到傷害。MDA是細(xì)胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量的高低可作為膜質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)MDA的量增加時(shí)，表明細(xì)胞膜受傷害程度的加深。MDA檢測(cè)結(jié)果表明:在正常條件下，轉(zhuǎn)基因油菜的MDA值和對(duì)照相差不大，但是在淹澇條件下，對(duì)照的MDA的量明顯上升，統(tǒng)計(jì)分析表明，對(duì)照油菜的MDA值比轉(zhuǎn)基因油菜的高，且差異顯著(見(jiàn)圖6)。

2.4.4 油菜淹澇脅迫下根部變化 為了研究轉(zhuǎn)基因植株的耐澇性，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行大量擴(kuò)繁，選取生長(zhǎng)一致的轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)化對(duì)照植株，在淹水條件下轉(zhuǎn)基因油菜根部同對(duì)照植株的比較，結(jié)果如圖7(彩圖見(jiàn)封三圖版)所示。從圖中看出，轉(zhuǎn)基因油菜雖然側(cè)根很多，但是碳化嚴(yán)重，非轉(zhuǎn)基因油菜側(cè)根較少，碳化相對(duì)輕微，差別不明顯。

3 討論

通過(guò)基因工程手段來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)植物抗逆性的改良已成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。本研究通過(guò)引入外源vgb基因，可降低細(xì)胞的臨界氧濃度，增強(qiáng)細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度，從而提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率，進(jìn)而加快植物生長(zhǎng)速率。VHb還可以通過(guò)促進(jìn)呼吸作用來(lái)增加ATP的濃度，間接地促進(jìn)植物的光合作用和生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)了葉綠素含量，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量增加，同時(shí)光合作用也得到增強(qiáng)，從而加快了植物的生長(zhǎng)。另一方面，轉(zhuǎn)vgb基因的植株可以保證氧濃度水平的相對(duì)穩(wěn)定，減少無(wú)氧呼吸，從而避免不必要的能量浪費(fèi)。

圖6 MDA的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照間的區(qū)別Fig.6 Differences of MDA contents between transgenic lines and control.

圖7 不同條件下的根部形態(tài)Fig.7 Root system of different plants in different treats.

在擴(kuò)繁過(guò)程中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這一基因的轉(zhuǎn)入可以增加油菜的生物量，提高種子萌發(fā)率，縮短萌發(fā)時(shí)間，提高油菜籽的產(chǎn)量，起到增產(chǎn)的作用。

通過(guò)對(duì)油菜進(jìn)行淹澇實(shí)驗(yàn)表明:轉(zhuǎn)入vgb基因的油菜具有明顯的抗?jié)衬芰Α．?dāng)非轉(zhuǎn)基因油菜的根部缺氧后，其能量代謝逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕴墙徒狻⒁掖己腿樗岚l(fā)酵等途徑為主，這樣不僅會(huì)造成物質(zhì)能量的大量消耗，而且會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基、乳酸、乙醇等有害物質(zhì)，從而造成根系的吸收大幅降低，葉片死亡，光合作用下降甚至停止。而轉(zhuǎn)基因植株中，VHb與氧有著很強(qiáng)的親和能力，能夠清除氧自由基，改變氧化磷酸化效率，抑制種子中不飽和脂肪酸氧化功能，增強(qiáng)了油菜根部同氧的結(jié)合能力。并且VHb位于整個(gè)胞質(zhì)中，可以使細(xì)胞能夠維持相對(duì)穩(wěn)定的氧濃度水平，進(jìn)而提高了植株的抗?jié)衬芰Α?/p>

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