李培玉， 張 銳， 孫國清， 馬 林， 薛計雄， 林 芹， 郭三堆

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程，北京100081;

2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052

油菜是我國重要的油料作物和蛋白質(zhì)飼料作物，也是食用植物油的主要來源之一。我國油菜種植面積以及總產(chǎn)量占世界的三分之一，是世界上最大的油菜產(chǎn)區(qū)［1］。但我國油菜產(chǎn)區(qū)降水量較大，經(jīng)常會發(fā)生嚴(yán)重的澇害［2，3］。澇害嚴(yán)重影響了我國油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此提高油菜的耐澇能力對于我國油菜可持續(xù)發(fā)展具有非常重大的意義。

澇害的本質(zhì)并不是植株體內(nèi)水分的不斷積累增加，而是長時間缺氧使根系功能減弱導(dǎo)致植物代謝途徑的改變，并產(chǎn)生許多有害物質(zhì)，如二氧化碳、硫化物等，進而影響植物的正常生長和發(fā)育，隨著危害程度的增加造成嚴(yán)重的傷害和減產(chǎn)［4～6］。而且由于缺氧造成作物根系損傷，植株在澇害解除以后也很難恢復(fù)生長，具有明顯的滯后效應(yīng)［7］。因此，如何提高油菜抗?jié)澈δ芰κ钱?dāng)前制約油菜可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題。

當(dāng)前，改良作物的耐澇能力主要是提高其無氧生活環(huán)境的適應(yīng)能力。Quimio等［8］在水稻漬水脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，厭氧環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)DC酶活性和乙醇的合成率減少了50%。在漬水脅迫過程中，通過限制酶活性的提高從而加快了代謝過程，進而提高了終產(chǎn)物乙醇的合成。一些轉(zhuǎn)錄因子也與作物耐漬性相關(guān)，但目前為止，只在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個轉(zhuǎn)錄因子AtMYB2［9］。

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla haemoglobin，VHb)是研究比較成熟的一種加氧蛋白(Vgb)。最初由Khosla等［10］從透明顫菌中克隆得到，并在大腸桿菌和酵母中表達，可以加強細胞的呼吸強度，降低細胞的臨界氧濃度，提高細胞的生長速率，使細胞在低氧甚至無氧條件下仍能保持生長優(yōu)勢［11～13］。已有將vgb基因引入植物細胞的研究，實驗證明該基因也可使轉(zhuǎn)基因植物發(fā)芽提前，并加快植物的生長，這可能與該基因可以增加細胞中的氧濃度相關(guān)［14］。

本研究首次通過基因工程手段將透明顫菌血紅蛋白基因過表達轉(zhuǎn)入油菜，驗證其在油菜增產(chǎn)和抗?jié)撤矫娴墓δ芎妥饔?，為vgb基因在油菜中的表達所產(chǎn)生的生物量和生理代謝變化提供了數(shù)據(jù)，為農(nóng)作物抗?jié)逞芯刻峁┝死碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本研究田間試驗于2010－2011年在湖北麻城進行。

1.2 試驗材料

甘藍型油菜中雙10號，由本實驗室保存。大腸桿菌菌株E.coli TOP10、質(zhì)粒pBI121，由本實驗室保存。其他質(zhì)粒均購自Promega公司。

1.3 表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

用PstⅠ和 XhoⅠ雙酶切 pGSKA質(zhì)粒和pG4ASVHB質(zhì)粒，得到pGSKA載體(4 kb)和vgb(452 bp)基因片段，經(jīng)過回收、連接，鑒定后得到中間載體pGSVKA。EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切中間載體pGSVKA，回收表達盒基因片段，克隆于pBI121質(zhì)粒中，并命名為pGBISVKA(見圖1)。

在油菜盛花期將已經(jīng)授粉的花朵摘去，采用直接噴花法或蘸花法轉(zhuǎn)化油菜花朵，轉(zhuǎn)化后的花朵做好標(biāo)記。

1.4 卡那霉素檢測

圖1 pGBISVKA質(zhì)粒載體圖譜Fig.1 Map of pGBISVKA plasmid vector.

選擇晴朗、無風(fēng)天氣的午后，配制2 000 mg/L的卡那霉素溶液，取脫脂棉浸入卡那霉素的溶液，然后貼附在油菜葉片的表面，或用噴壺將卡那霉素溶液均勻噴灑在油菜葉片表面，一周后觀察試驗結(jié)果?？敲顾孛舾兄仓甑娜~片在接觸卡那霉素處呈黃色，不敏感植株的葉片無變化。

1.5 PCR 檢測

按照J(rèn)oobeur等［15］的方法提取油菜基因組。根據(jù)vgb基因的CDS序列設(shè)計引物:vgbF:5'-ggctgcaggcttgatcaacagac-3'和 vgbR:5'-agctcgagctcaacagcttgagcgtac-3'。以轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR體系50 μL:1 μL基因組 DNA，5 μL 10 × PCR buffer，5 μL dNTPs，1 μL vgbF(10 μmol/L)，1 μL vgbR(10 μmol/L)，0.5 μL Taq 酶(2.5 U/μL)，ddH2O 38.5 μL。PCR擴增程序為:95℃ 5min;95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2.5min，35 個循環(huán);72℃ 5min。4℃，保存。電泳檢測結(jié)果。

1.6 Southern 雜交檢測

Southern雜交檢測采用地高辛隨機引物標(biāo)記法標(biāo)記探針，化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)進行檢測［16］。

1.7 耐澇性檢測

油菜的淹水試驗在經(jīng)人工處理的不滲漏的淹水池進行。普通田地向下挖40～45cm，鋪設(shè)防水塑料布，然后用土填平，旁邊起埂，施肥后人工播種，在油菜花期進行為期15 d的淹水實驗，每天下午6點人工往淹水池里灌水，水面保持在油菜根部4～5cm處。淹水結(jié)束后從轉(zhuǎn)基因株系中挑選出生長狀況基本一致的15個株系進行生理指標(biāo)測定［17，18］，包括丙二醛、脯氨酸和超氧化物歧化酶的測定，進行3次重復(fù)。然后拔出，洗凈，比較在淹澇條件下根部的形態(tài)變化。試驗采用三重復(fù)隨機區(qū)組設(shè)計試驗。

1.8 統(tǒng)計分析

對原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素篩選

在油菜的苗期用卡那霉素篩選，先采用大面積噴灑卡那霉素溶液進行初篩，然后將不變色的油菜用脫脂棉浸泡卡那霉素溶液后，貼在油菜葉片表面，最終獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株11株。

2.2 PCR 鑒定

提取轉(zhuǎn)基因油菜葉片的基因組DNA，以稀釋10倍的基因組為模板，以vgbF和vgbR為引物，以非轉(zhuǎn)基因油菜為對照，以pGBISVKA質(zhì)粒為陽性對照進行 PCR，轉(zhuǎn)基因植株樣品擴增出約450 bp條帶，與預(yù)期的長度完全一致，而陰性對照材料(中雙10號)PCR擴增結(jié)果未出現(xiàn)相應(yīng)的電泳圖譜，如圖2所示。

圖2 PCR鑒定轉(zhuǎn)vgb基因油菜植株Fig.2 PCR identification of vgb transgenic plants.

2.3 Southern 雜交分析

為了檢測外源基因在油菜基因組中的整合情況，對轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA進行EcoRⅠ單酶切，以vgb基因標(biāo)記探針開展Southern雜交，結(jié)果見圖3。Southern雜交結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系中出現(xiàn)了兩條明顯雜交條帶，表明所檢測的轉(zhuǎn)基因油菜是雙拷貝整合。

圖3 轉(zhuǎn)vgb基因植株的Southern blot分析Fig.3 Southern blot detection of vgb transgenic plants.

2.4 轉(zhuǎn)基因油菜耐澇性分析

2.4.1 澇漬脅迫處理對轉(zhuǎn)vgb基因油菜脯氨酸含量的影響 在正常供水條件下(見圖4)，轉(zhuǎn)基因油菜和對照植株葉片脯氨酸含量較為正常，各材料之間脯氨酸含量差異不顯著。但是在淹水條件下，各材料的脯氨酸含量均出現(xiàn)不同程度的變化，非轉(zhuǎn)基因植株11～15在其淹水前后變化很明顯，脯氨酸含量較高，而轉(zhuǎn)基因植株1～10變化不明顯。說明轉(zhuǎn)vgb基因的油菜在淹水過程中已經(jīng)基本適應(yīng)了淹水的環(huán)境，已不需要脯氨酸的調(diào)節(jié)，但對照油菜則受到淹水的危害很嚴(yán)重，且很難恢復(fù)正常水平。

2.4.2 淹澇脅迫處理下對油菜SOD活力的影響對油菜進行為期15 d的淹澇實驗，采集樣品測定SOD酶活，結(jié)果如圖5所示。在正常供水條件下，轉(zhuǎn)基因油菜和對照SOD酶活的差異不明顯。而在淹水條件下，測得轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活性雖然有所降低，但與正常供水情況差距并不明顯，而對照植株的 SOD酶活性顯著下降，約50%的降幅。與對照相比，淹水條件下，轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活保持相對穩(wěn)定。而SOD酶活性的急劇變化，暗示著產(chǎn)生的SOD不能夠完全清除氧自由基，積累的氧自由基可能會對植物體產(chǎn)生損害，造成損失。實驗結(jié)果顯示的轉(zhuǎn)vgb基因油菜的SOD酶活性受淹水影響較小，說明植株已經(jīng)適應(yīng)了淹澇環(huán)境，并且SOD的合成已經(jīng)逐漸恢復(fù)，這有利于油菜的體內(nèi)的自由基的清除，使損失降低。

圖4 脯氨酸的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對照間的區(qū)別Fig.4 Differences of proline contents between transgenic lines and the control.

圖5 SOD的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對照間的區(qū)別Fig.5 Differences of SOD contents between transgenic lines and the control.

2.4.3 油菜淹澇脅迫下對轉(zhuǎn)基因油菜丙二醛含量的影響 在干旱、水澇等條件下，植物體內(nèi)常發(fā)生質(zhì)膜過氧化作用，破壞膜系統(tǒng)，導(dǎo)致植物受到傷害。MDA是細胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低可作為膜質(zhì)過氧化的指標(biāo)，當(dāng)細胞內(nèi)MDA的量增加時，表明細胞膜受傷害程度的加深。MDA檢測結(jié)果表明:在正常條件下，轉(zhuǎn)基因油菜的MDA值和對照相差不大，但是在淹澇條件下，對照的MDA的量明顯上升，統(tǒng)計分析表明，對照油菜的MDA值比轉(zhuǎn)基因油菜的高，且差異顯著(見圖6)。

2.4.4 油菜淹澇脅迫下根部變化 為了研究轉(zhuǎn)基因植株的耐澇性，對轉(zhuǎn)基因株系進行大量擴繁，選取生長一致的轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)化對照植株，在淹水條件下轉(zhuǎn)基因油菜根部同對照植株的比較，結(jié)果如圖7(彩圖見封三圖版)所示。從圖中看出，轉(zhuǎn)基因油菜雖然側(cè)根很多，但是碳化嚴(yán)重，非轉(zhuǎn)基因油菜側(cè)根較少，碳化相對輕微，差別不明顯。

3 討論

通過基因工程手段來實現(xiàn)對植物抗逆性的改良已成為人們關(guān)注的重點。本研究通過引入外源vgb基因，可降低細胞的臨界氧濃度，增強細胞的呼吸強度，從而提高細胞生長速率，進而加快植物生長速率。VHb還可以通過促進呼吸作用來增加ATP的濃度，間接地促進植物的光合作用和生長。在實驗中還檢測了葉綠素含量，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量增加，同時光合作用也得到增強，從而加快了植物的生長。另一方面，轉(zhuǎn)vgb基因的植株可以保證氧濃度水平的相對穩(wěn)定，減少無氧呼吸，從而避免不必要的能量浪費。

圖6 MDA的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對照間的區(qū)別Fig.6 Differences of MDA contents between transgenic lines and control.

圖7 不同條件下的根部形態(tài)Fig.7 Root system of different plants in different treats.

在擴繁過程中進一步發(fā)現(xiàn)，這一基因的轉(zhuǎn)入可以增加油菜的生物量，提高種子萌發(fā)率，縮短萌發(fā)時間，提高油菜籽的產(chǎn)量，起到增產(chǎn)的作用。

通過對油菜進行淹澇實驗表明:轉(zhuǎn)入vgb基因的油菜具有明顯的抗?jié)衬芰?。?dāng)非轉(zhuǎn)基因油菜的根部缺氧后，其能量代謝逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕴墙徒?、乙醇和乳酸發(fā)酵等途徑為主，這樣不僅會造成物質(zhì)能量的大量消耗，而且會產(chǎn)生大量氧自由基、乳酸、乙醇等有害物質(zhì)，從而造成根系的吸收大幅降低，葉片死亡，光合作用下降甚至停止。而轉(zhuǎn)基因植株中，VHb與氧有著很強的親和能力，能夠清除氧自由基，改變氧化磷酸化效率，抑制種子中不飽和脂肪酸氧化功能，增強了油菜根部同氧的結(jié)合能力。并且VHb位于整個胞質(zhì)中，可以使細胞能夠維持相對穩(wěn)定的氧濃度水平，進而提高了植株的抗?jié)衬芰Α?/p>

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