樊璐，李宏梁，*，唐欣，張莉，樊成，劉倩，黃峻榕

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安710048）

乳酸菌發(fā)酵法檢測鮮乳和乳粉中的兩種抗生素殘留

樊璐1，李宏梁1，*，唐欣2，張莉2，樊成2，劉倩1，黃峻榕1

（1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安710048）

根據(jù)抗生素能抑制乳酸菌發(fā)酵的原理，建立了用乳酸菌發(fā)酵檢測鮮乳及乳粉中青霉素和頭孢噻呋殘留的方法。通過向無抗乳中添加抗生素，接種乳酸菌，測定發(fā)酵過程中的pH，得出兩種抗生素的檢測限。結(jié)果表明：以鮮乳為本底時(shí)，青霉素和頭孢噻呋的檢測限分別為0.08U/mL、0.08μg/mL；以乳粉為本底時(shí)，青霉素和頭孢噻呋的檢測限分別為0.1U/mL、0.08μg/mL。該方法簡單、快速、價(jià)格低廉，適于推廣。

乳酸菌法；乳及乳粉；抗生素殘留；pH；檢測限

抗生素是細(xì)菌、霉菌或其他微生物的代謝產(chǎn)物或人工合成的類似物，通俗地講，抗生素就是用于治療各種細(xì)菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。乳中抗生素殘留的原因，主要是畜牧業(yè)在治療牲畜疾病時(shí)濫用抗生素；其次是在飼料中以長期小劑量的方式添加抗生素；第三是為了防止乳酸敗、延長保質(zhì)期而有意添加[1]。乳中抗生素殘留，不僅嚴(yán)重影響酸乳的生產(chǎn)（抗生素對乳酸菌有抑制作用），而且人長期飲用含抗生素的乳品后，抗生素在人體內(nèi)不斷積累，可能導(dǎo)致人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)，腸道細(xì)菌產(chǎn)生一定的耐藥性等[2]，更加嚴(yán)重的，如氯霉素，會(huì)導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥[3]，危害身體健康。

目前抗生素的檢測方法大體分為微生物法、理化法和免疫學(xué)法[4]。理化法由于設(shè)備昂貴、過程復(fù)雜、費(fèi)用較高，一般用于單一抗生素檢測；免疫學(xué)法因檢測范圍局限且費(fèi)用昂貴而不易推廣。實(shí)踐表明，凡是能夠發(fā)酵酸乳的乳源都是來自未得乳房炎等疾病，未注射消炎針和防疫針的健康乳牛，反過來，乳酸菌不能在有抗牛乳中發(fā)酵酸乳。因此，從理論上講，通過乳酸菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明某種乳源是否適合于發(fā)酵酸乳，從而證明該乳源是無抗還是有抗，也從而可以證明該乳源是否含有對乳酸菌有足夠抑制作用的抗生素。本實(shí)驗(yàn)方案為首先在無抗乳中人為添加兩種獸用抗生素，然后進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，最后通過測定發(fā)酵乳pH的變化得出該兩種抗生素對乳酸菌完全抑制的最小濃度，從而建立乳酸菌發(fā)酵過程中pH變化與乳中抗生素殘留量之間的關(guān)系。本研究結(jié)果將為乳酸菌發(fā)酵法鑒別有抗乳提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳酸菌YO-MIXTM499 LYO：丹尼斯克（中國）有限公司。

1.1.2 藥品

青霉素（純度93.9%）：中國藥品生物制品檢定所；混感頭孢王（相當(dāng)于頭孢噻呋0.5 g/支）：合肥愛瑞特生物制藥有限公司。

1.1.3 材料

無抗生素脫脂乳粉：陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所提供；鮮牛乳，乳粉：市售；所用材料經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)方法[5]檢測抗生素殘留為陰性。

1.1.4 試劑

2，3，5-氯化三苯四氮唑（4%）（AR）：上海遠(yuǎn)帆助劑廠；磷酸二氫鉀（AR）、磷酸二氫鈉（AR）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SG2酸度計(jì)（pH計(jì)）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MLS-3780不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-150B（F）生化培養(yǎng)箱：上海瑞豐儀器儀表有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 滅菌脫脂乳

無抗生素脫脂乳粉適量，以蒸餾水10倍稀釋，加熱至完全溶解，115℃滅菌20min。

1.3.2 無菌磷酸鹽緩沖液（pH為7.3±0.1）[5]

準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鈉2.83 g，磷酸二氫鉀1.36 g，蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)pH為7.3±0.1，121℃高壓滅菌20min，冷卻后置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 不同濃度抗生素的配制

精密稱取樣品（青霉素標(biāo)準(zhǔn)品3.850 8mg、頭孢噻呋1.050 0mg），溶于無菌磷酸鹽緩沖液中，使其濃度稀釋為100U/mL～1000U/mL或者100μg/mL～1000μg/mL，再將該溶液用滅菌的無抗脫脂乳稀釋至所需濃度，分裝于無菌試管中，密封備用。

1.4 方法

1.4.1 測試菌液的制備

原料乳經(jīng)過驗(yàn)收，在90℃滅菌10min[6]，迅速冷卻到37℃以下，加入適量凍干乳酸菌粉，攪拌15min，封裝，42℃培養(yǎng)4 h待用。將發(fā)酵好的酸乳按1∶1加入滅菌無抗脫脂乳進(jìn)行稀釋，備用。

1.4.2 檢測限的測定

量取鮮乳或乳粉復(fù)原液（檢測前將乳粉用去離子水復(fù)原）適量分別加入到試管中，90℃滅菌10min，迅速冷卻到37℃以下，加入不同濃度梯度的抗生素和測試菌液（接種量為總量的10%[7]），樣品總量為30mL，測定初始pH，然后放入42℃水浴培養(yǎng)1.5 h，期間每隔30min測一次pH[8]，每個(gè)梯度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)測定空白對照樣，分析數(shù)據(jù)。

1.4.3 市售乳樣品的測定

為了驗(yàn)證此方法的實(shí)際應(yīng)用效果，對市場上不同的液態(tài)奶和奶粉進(jìn)行抽樣檢測，其中鮮乳共35種，乳粉共12種。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵時(shí)間的選擇

在相同溫度下，以鮮乳和乳粉為本底，加入乳酸菌發(fā)酵。在發(fā)酵的不同時(shí)間段分別測定pH，確定發(fā)酵時(shí)間。每組做三個(gè)平行樣和一個(gè)陽性對照樣，鮮乳和乳粉的編號依次為1-6。結(jié)果如表1所示。

表1 發(fā)酵乳樣品在乳酸菌發(fā)酵不同時(shí)間的pH變化Table1 The pH variation of fermented milk samples at different time during lactic acid bacteria fermentation

從表1可以看出，無抗生素的乳樣本底隨著乳酸菌發(fā)酵時(shí)間的增加，pH依次降低，說明乳酸菌發(fā)酵正常。添加抗生素的（陽性）乳樣本底在前60min，pH依次降低；60min之后，pH基本保持不變，說明乳酸菌的生長受抑制。發(fā)酵90min后，與初始pH相比，發(fā)酵活性正常時(shí)，發(fā)酵乳樣的pH明顯下降，降低值大于0.3；發(fā)酵活性不正常時(shí)，發(fā)酵乳樣的pH的降低值小于0.3。因此，為了在短時(shí)間能快速得出結(jié)論，確定選擇發(fā)酵時(shí)間為90min，與初始值相比，pH降低值小于0.3作為抗生素存在的判斷依據(jù)。

2.2 抗生素對乳酸菌發(fā)酵的抑制

對實(shí)際含有青霉素濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 U/mL[9]，頭孢噻呋濃度為0.08、0.1、0.2、0.4μg/mL[10]的本底（分別為鮮乳及乳粉）樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表2和表3。

表2 不同濃度的青霉素對發(fā)酵酸乳樣品pH的影響Table2 The impact of different concentrations of penicillin on pH of fermented milk samples

表3 不同濃度頭孢噻呋對發(fā)酵酸乳樣品pH的影響Table3 The impact of different concentrations of ceftiofur on pH of fermented milk samples

從表2可以看出，與空白對照相比，以鮮乳為本底時(shí)，濃度為0.02、0.04、0.06、0.08U/mL的青霉素對乳酸菌有抑制作用，但不明顯，90min時(shí)pH的降低值都大于0.3；濃度為0.1 U/mL青霉素對乳酸菌的抑制程度很大，90min時(shí)pH的降低值小于0.3。說明當(dāng)青霉素濃度大于0.08 U/mL時(shí)，對鮮乳中乳酸菌有明顯的抑制作用。

以乳粉為本底時(shí)，濃度為0.1U/mL的青霉素對乳酸菌有抑制作用，但不明顯，90min時(shí)pH的降低值大于0.3；濃度為0.2、0.4、0.6、0.8U/mL的青霉素對乳酸菌抑制作用很大90min時(shí)pH的降低值小于0.3。說明當(dāng)青霉素濃度大于0.1U/mL時(shí)，對乳粉中乳酸菌有明顯的抑制作用。

從表3可以看出，與空白對照相比，以鮮乳為本底時(shí)，濃度為0.08μg/mL的頭孢噻呋對乳酸菌抑制作用很小，90min時(shí)pH的降低值大于0.3；濃度為0.1、0.2、0.4μg/mL的頭孢噻呋對乳酸菌抑制作用很大，90min時(shí)pH的降低值都小于0.3。說明當(dāng)頭孢噻呋濃度大于0.08μg/mL時(shí)，對鮮乳中乳酸菌的發(fā)酵有明顯的抑制作用。

以乳粉為本底時(shí)，濃度為0.08μg/mL的頭孢噻呋濃度對乳酸菌抑制作用很小，90min時(shí)pH的降低值大于0.3；濃度為0.1μg/mL時(shí)，抑制作用開始變的明顯；濃度為0.2、0.4μg/mL的頭孢噻呋對乳酸菌抑制作用很大，90min以后pH的降低值都小于0.3。說明當(dāng)頭孢噻呋濃度大于0.08μg/mL時(shí)，對乳粉中乳酸菌有明顯的抑制作用。

2.3 對市售乳樣品的檢驗(yàn)結(jié)果

對抽取的市售35種鮮乳和12種乳粉，分別采用乳酸菌發(fā)酵法和國標(biāo)方法進(jìn)行抗生素殘留的檢測，結(jié)果見表4。

表4 市售乳樣品的抗生素殘留測定結(jié)果Table4 The antibiotic residues detection results of commercial milk samples

從表4可以看出，用乳酸菌發(fā)酵法檢測市售乳樣品（鮮乳和乳粉共37種）中抗生素殘留的結(jié)果和國家標(biāo)準(zhǔn)方法[5]的檢測結(jié)果一致。與國標(biāo)法相比，乳酸菌發(fā)酵法對鮮乳和乳粉中青霉素和頭孢噻呋殘留的檢測更簡單和快速，且價(jià)格低廉，適于推廣。

3 結(jié)論和小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)研究建立了用乳酸菌發(fā)酵檢測鮮乳及乳粉中青霉素和頭孢噻呋殘留的方法，確定了乳酸菌發(fā)酵法用于檢測鮮乳及乳粉中抗生素殘留的檢測限。以鮮乳為本底時(shí)，青霉素和頭孢噻呋的檢測限分別為0.08U/mL、0.08μg/mL；以乳粉為本底時(shí)，青霉素和頭孢噻呋的檢測限分別為0.1U/mL、0.08μg/mL。應(yīng)用該方法對市售隨機(jī)抽查樣品的檢測結(jié)果，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測結(jié)果一致。該方法的檢測時(shí)間從傳統(tǒng)微生物法（即國標(biāo)法）的3 h～5 h縮短至2 h，而且操作更簡單，價(jià)格更低廉，不需要特殊設(shè)備。

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Determination of Two Antibiotic Residues in Milk and Milk Powder by the Method of Lactic Acid Bacteria Fermentation

FAN Lu1，LI Hong-liang1，*，TANG Xin2，ZHANG Li2，F(xiàn)AN Cheng2，LIU Qian1，HUANG Jun-rong1
（1.College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an，710021；Shaanxi，China；2.Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an，710048，Shaanxi，China）

Lactic acid bacteria fermentation can be restricted by antibiotics.The method of lactic acid bacteria fermentation for determination of two antibiotic（penicillin and ceftiofur）residues in milk and milk powder was established.The detection limits of two antibiotics were obtained by adding antibiotics to non-anti-milk，inoculating lactic acid bacteria and determining pH during fermentation.The results showed that，when milk was used as background，detection limits of penicillin and ceftiofur were 0.08 U/mL and 0.08μg/mL，when milk powder was used as background，detection limits of penicillin and ceftiofur were 0.1U/mL and 0.08μg/mL.This method is simple，rapid，and inexpensive，and suitable for promotion.

lactic acid bacteria；milk and milk powder；antibiotic residues；pH；detection limit

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.023

2014-01-13

樊璐（1988—），女（漢），碩士，研究方向：食品微生物。

*通信作者