張世芹，吳新文，魏 杰，陳迎麗，王 睿

(貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550014)

噻呋酰胺是噻唑酰胺類殺菌劑，在葉面噴霧或土壤澆灌時，能迅速被植物根和葉吸收，并在整個植物體的木質(zhì)部和質(zhì)外體傳導(dǎo)，常用于水稻、馬鈴薯、玉米和市容草，主要防治擔(dān)子菌綱真菌引起的紋枯病[1-3]。己唑醇是三唑類殺菌劑，具有保護和治療活性，用于防治子囊菌和擔(dān)子菌引起的病害，能有效防治紋枯病、白粉病和黑星病、葡萄黑腐病和白粉病、咖啡銹病、花生葉斑病等[4-5]。二者復(fù)配對水稻紋枯病的有效防治以及緩解單一藥劑長期使用可能導(dǎo)致的病原菌抗藥性風(fēng)險具有非常明顯的特效作用[6-7]。

目前，噻呋酰胺和己唑醇分別已經(jīng)報道了液相色譜、氣相色譜以及GC-MS的分析方法[8-15]，而二者復(fù)配制劑沒有相關(guān)國家標準、行業(yè)標準以及地方標準，關(guān)于有效成分同時分析也鮮有公開報道[16-17]。本試驗建立了一種對27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中的有效成分同時進行定量分析的高效液相色譜方法，該方法操作更為簡便、快速，分離效果好，線性關(guān)系、準確度和精密度均滿足要求，檢測機構(gòu)間驗證結(jié)果亦符合性良好，適用于生產(chǎn)和監(jiān)管環(huán)節(jié)中的質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 試劑和溶液 甲醇(HPLC級)，超純水(電阻率，18.2 MΩ·cm，25℃)，噻呋酰胺標準品(ω=99.0%)，己唑醇標準品(ω=99.0%)，27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1260，具有DAD檢測器；Agilent色譜數(shù)據(jù)處理工作站；梅特勒-托利多電子天平XSE205DU型；明澈超純水制備系統(tǒng)；色譜柱：Thermo Scientific AcclaimTM120 C18(250mm×4.6mm，5μm)。

1.3 高效液相色譜操作條件 流動相：體積比Ψ(甲醇﹕水)=75：25，流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，進樣體積：5μL，檢測波長：230nm。在上述色譜操作條件下噻呋酰胺保留時間約為8.2min，己唑醇保留時間約為13.2min。標樣及27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑的高效液相色譜(圖1、圖2)。

圖1 噻呋酰胺、己唑醇標樣色譜圖

圖2 27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑色譜圖

1.4 測定步驟

1.4.1 標樣溶液的配制 準確稱取噻呋酰胺標準品0.025g、己唑醇標準品0.025g，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到噻呋酰胺、己唑醇的混合標樣儲備液。

1.4.2 試樣溶液的配制 稱取含0.025g噻呋酰胺的試樣，置于50mL容量瓶中，先加入5mL水使試樣分散，再加入甲醇溶解，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾。

1.5 測定 在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，直至相鄰2針噻呋酰胺和己唑醇峰面積相對變化<1.2%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.6 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中噻呋酰胺和己唑醇峰面積分別進行平均。試樣中噻呋酰胺(己唑醇)質(zhì)量分數(shù)按式(1)計算：

(1)

式中：

ω1——試樣中噻呋酰胺(己唑醇)的質(zhì)量分數(shù)，%；

A2——試樣溶液中噻呋酰胺(己唑醇)峰面積的平均值；

m1——標樣的質(zhì)量，g；

ω——標樣中噻呋酰胺(己唑醇)的質(zhì)量分數(shù)，%；

A1——標樣溶液中噻呋酰胺(己唑醇)峰面積的平均值；

m2——試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇 使用Agilent 1260的DAD檢測器將檢測波長調(diào)整為波長掃描范圍為190～400nm對噻呋酰胺、己唑醇標樣進行3D譜圖掃描，得到噻呋酰胺、己唑醇的紫外吸收曲線圖及光譜圖，從圖中可以看到噻呋酰胺(204nm)和己唑醇(202nm)在205nm附近出現(xiàn)最大吸收，甲醇溶劑的截止波長和背景吸收可能會對目標峰產(chǎn)生一定分析干擾，且選擇在230nm波長處，標樣及試樣中噻呋酰胺與己唑醇上行峰光譜圖與下行峰光譜圖一致，且噻呋酰胺和己唑醇標樣、27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中有效成分峰純度值均>990，確認有效成分處無其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求(圖3、圖4)。

圖3 噻呋酰胺、己唑醇紫外吸收曲線

圖4 噻呋酰胺、己唑醇HPLC-DAD峰純度色譜圖

根據(jù)企業(yè)標準信息公共服務(wù)平臺中同類產(chǎn)品的企業(yè)標準和2012版《農(nóng)藥分析手冊》。經(jīng)過反復(fù)測試的結(jié)果顯示：選擇250mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝C18、5μm填充物的反相色譜柱，當流速控制在1.0mL/min，流動相甲醇+水=75+25(V/V)時，分析時間適宜，分離度及峰型較好。

2.2 線性相關(guān)性測定 在一定質(zhì)量范圍內(nèi)，按照濃度遞增的順序配制數(shù)個噻呋酰胺(己唑醇)混合標樣樣品，在1.3的色譜條件下，測定噻呋酰胺(己唑醇)的峰面積，取2次測定的平均結(jié)果。以噻呋酰胺(己唑醇)質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，分別得到噻呋酰胺的線性方程為y=8.961 7x-10.038，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8；己唑醇的線性方程為y=6.021 7x-1.917，相關(guān)系數(shù)R2為1.000 0，結(jié)果(表1、圖5)。

表1 線性范圍的測定結(jié)果

圖5 噻呋酰胺、己唑醇線性關(guān)系圖

2.3 分析方法的精密度 準確稱取6個供試物，在上述色譜操作條件下進行分析，計算噻呋酰胺、己唑醇的標準偏差和變異系數(shù)，結(jié)果顯示本方法對27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中噻呋酰胺和己唑醇的含量測定有良好的精密度，滿足NT/T 2887—2016《農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量分析方法確認指南》3.3制劑中有效成分和相關(guān)雜質(zhì)關(guān)于精密度(重復(fù)性)的要求，結(jié)果(表2)。

表2 分析方法的精密度測定結(jié)果

2.4 分析方法的準確度試驗 稱取已知質(zhì)量分數(shù)的試樣5份，分別加入一定量的噻呋酰胺(己唑醇)標準樣品，在1.3的色譜條件下測定噻呋酰胺(己唑醇)含量并計算回收率，噻呋酰胺的回收率范圍為99.25%～101.46%，己唑醇的回收率范圍為99.26%～101.92%，均滿足NT/T 2887—2016《農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量分析方法確認指南》3.3制劑中有效成分和相關(guān)雜質(zhì)關(guān)于準確度的要求，結(jié)果(表3)。

表3 準確度試驗結(jié)果

2.5 實驗室間驗證試驗 將用于建立方法的27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑和標樣，發(fā)送至其他3家檢測實驗室，要求按照已建立的方法進行方法驗證試驗。各單位在2個不同日期對樣品含量進行重復(fù)測定，從統(tǒng)計結(jié)果看，27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中噻呋酰胺再現(xiàn)性相對標準偏差RSDR為1.622 1%；己唑醇再現(xiàn)性相對標準偏差RSDR為0.963 5%，都<相應(yīng)的Horwitz公式2(1-0.51ogC)理論計算值，表明不同實驗室間的檢測結(jié)果符合性良好，該方法可以滿足日常檢測工作需要，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果(表4)。

表4 各單位驗證試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

續(xù)表

3 結(jié)論

試驗建立了27.8%噻呋酰胺·己唑醇懸浮劑中有效成分的液相色譜分析方法，該方法操作簡便、快速，分離效果好，線性關(guān)系、準確度和精密度均滿足要求，不同檢測機構(gòu)運用該方法檢測結(jié)果符合性亦良好，適用于生產(chǎn)和監(jiān)管環(huán)節(jié)中對噻呋酰胺和己唑醇復(fù)配制劑中有效成分的質(zhì)量檢測。