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        超高效液相色譜法測定頭孢噻呋晶體注射液中頭孢噻呋含量

        2020-11-03 10:09:58魏秀麗王艷芬楊志昆馮言言張傳津徐恩民李有志
        中國獸藥雜志 2020年10期
        關(guān)鍵詞:噻呋液相色譜儀頭孢

        魏秀麗,常 雪,王艷芬,楊志昆,馮言言,張傳津*,徐恩民*,李有志

        (1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗所,山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點實驗室,動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實驗室,濟南250022;2.齊魯動物保健品有限公司,濟南250100)

        頭孢噻呋晶體注射液是一種緩釋制劑,活性成分是頭孢噻呋,用于治療和預(yù)防溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和睡眠嗜血桿菌感染引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病(肺炎,運輸熱),以及治療胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]。在中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號等文獻(xiàn)中頭孢噻呋晶體及其注射液或其他相關(guān)制劑對頭孢噻呋含量測定均采用高效液相色譜方法[3-8],檢測所用流動相配制比較復(fù)雜,有機試劑品種較多,對實驗室人員操作性要求較高。本實驗開發(fā)了超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測法(UPLC-PDA)測定頭孢噻呋晶體注射液中頭孢噻呋的含量,與高效液相色譜法相比建立的方法流動相組成簡單,配制容易,毒性相對較小,簡單快速,經(jīng)濟環(huán)保。

        1 材料與方法

        1.1 藥品及試劑 頭孢噻呋對照品,批號K0331711,含量89.5%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;乙腈、冰醋酸、甲醇、四氫呋喃等均為色譜純;醋酸銨、正丁醇、二甲基甲酰胺、正己烷、氫氧化四丁基銨等為分析純;超純水。

        頭孢噻呋晶體注射液(豬用),來自齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品,規(guī)格,50 mL:5 g,100 mL:10 g;頭孢噻呋晶體注射液(牛用),來自齊魯動物保健品有限公司產(chǎn)品,規(guī)格,50 mL:10 g,100 mL:20 g。

        1.2 儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀,配備二極管陣列檢測器,美國waters 公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,配備紫外檢測器,美國安捷倫公司。分析天平,感量0.00001 g,瑞士梅特勒公司。

        1.3 方法

        1.3.1 供試品溶液制備 嚴(yán)格按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號頭孢噻呋晶體注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精密稱取頭孢噻呋對照品44.7 mg,按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號頭孢噻呋晶體注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制成400 μg/mL儲備液。

        1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取儲備液適量,配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液:每1 mL含頭孢噻呋200、80、40、20、8、4、2 μg的溶液。

        1.3.4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱:C8色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);以乙腈為流動相A,0.1%甲酸為流動相B,按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;光電二極管陣列檢測器,掃描范圍190~400 nm,檢測波長為292 nm,柱溫35 ℃,進(jìn)樣室溫度10 ℃,流速0.35 mL/min,進(jìn)樣量1 μL。

        表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition

        1.3.5 重復(fù)性試驗和精密度試驗 精密吸取頭孢噻呋對照品儲備溶液,制成每1 mL含頭孢噻呋40 μg的對照品溶液,重復(fù)配制6份,進(jìn)樣,計算其峰面積RSD。精密吸取上述對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,計算其峰面積RSD。

        1.3.6 檢測限和定量限的測定 對頭孢噻呋的標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行UPLC的分析,并逐級降低其濃度,以溶液檢測時的信噪比S/N≥3作為檢測限、S/N≥10作為定量限。

        1.3.7 不同色譜條件樣品檢測比較 分別使用高效液相色譜儀(參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第11號文[1],紫外檢測器,254 nm;流速:1.5 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL)和超高效液相色譜儀(光電二極管陣列檢測器,254、292 nm;流速:0.35 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL)在不同的色譜條件下運行,對同一樣品中頭孢噻呋的含量和出峰時間分別進(jìn)行比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下,測得頭孢噻呋色譜峰峰形良好,且均達(dá)到基線分離,在1.3.4項條件下,頭孢噻呋對照品和頭孢噻呋晶體注射液樣品,色譜保留時間約為5.05 min,分離度均滿足要求。頭孢噻呋UPLC色譜圖見圖1。

        (a.40 μg/mL頭孢噻呋對照品;b.10%頭孢噻呋晶體注射液;c.20%頭孢噻呋晶體注射液)圖1 UPLC圖(254 nm 1 μL)Fig 1 (40 μg/mL Ceftiofur reference,10% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection,20% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection)chromatogram UPLC 254 nm 1 μL

        2.2 線性 在選定的色譜條件下,使用梯度洗脫的方法,可以有效地分離目的峰,頭孢噻呋在4~200 μg/mL的范圍內(nèi),線性回歸方程為y=6417.2x-2328.8,R2>0.9998。其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

        圖2 頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of Ceftiofur

        2.3 重復(fù)性和精密度試驗 在選定的色譜條件下,配制40 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液,重復(fù)配制6份,進(jìn)樣,測得頭孢噻呋峰面積RSD為0.33%;取40 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,測得頭孢噻呋峰面積RSD為0.21%,均滿足實驗要求。

        2.4 檢測限和定量限 2 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液信噪比≥3,為檢出限,4 μg/mL頭孢噻呋對照品溶液信噪比≥10,為定量限。

        2.5 不同色譜條件樣品檢測結(jié)果的比較 不同色譜條件下的主成分理論塔板數(shù)、保留時間等參數(shù)的比較見表2。

        表2 不同色譜條件下的主成分不同色譜參數(shù)的比較Tab 2 Comparison of principal components and chromatographic parameters under different chromatographic conditions

        由表2可見,使用的Waters 的C8 色譜柱理論塔板數(shù)非常高,性能是完全滿足要求的。通過響應(yīng)值比較及光譜圖各成分的最大吸收波長為254 nm和292 nm,兩波長結(jié)果偏差極小,小于1%,都能滿足檢測需求;農(nóng)業(yè)農(nóng)村部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選擇的254 nm,但292 nm的響應(yīng)值較高,所以選擇292 nm。光譜圖見圖3;色譜圖見圖1、圖4。保留時間為約5.05 min,滿足檢測需求。

        圖3 頭孢噻呋對照品光譜圖Fig 3 Ceftiofur control spectrum

        使用Waters超高效液相色譜儀(本實驗色譜條件1.3.4項)和高效液相色譜儀(1.3.7項),對同一樣品中頭孢噻呋的含量分別進(jìn)行了比較,無顯著差異,相對偏差均小于1%,表明本實驗方法簡單可行,結(jié)果精確可靠。結(jié)果如表3所示。

        表3 不同色譜條件檢測結(jié)果表 (n=4)Tab 3 Test results using different chromatographic method (n=4)

        由于兩種色譜方法均已通過其方法學(xué)驗證,均可以準(zhǔn)確控制其指標(biāo)成分。從檢測效率上看,優(yōu)選超高效液相色譜法(UPLC),各色譜圖見圖1、圖4、圖5。從樣品噪音和峰形分離度等方面來看,優(yōu)選超高效液相色譜儀條件,背景更干凈,與雜質(zhì)峰的分離度更好。

        (a.40 μg/mL頭孢噻呋對照品;b.10%頭孢噻呋晶體注射液;c.20%頭孢噻呋晶體注射液) (40 μg/mL Ceftiofur reference,10% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection,20% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection)圖4 UPLC圖(292 nm,1 μL)Fig 4 chromatogram UPLC 292 nm 1 μL

        (a.40 μg/mL頭孢噻呋對照品;b.10%頭孢噻呋晶體注射液;c.20%頭孢噻呋晶體注射液) (40 μg/mL Ceftiofur reference,10% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection,20% Ceftiofur Crystalline Free Acid Injection)圖5 HPLC圖(254 nm 1 μL)Fig 5 chromatogram HPLC 254 nm 1 μL

        3 討論與結(jié)論

        3.1 UPLC方法色譜柱耐用性實驗 本研究將頭孢噻呋的對照溶液利用PDA檢測器采集其光譜圖,在波長190~400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,頭孢噻呋在254/292 nm處有最大吸收,根據(jù)光譜圖可以判斷含有主成分;改變流速0.34、0.36 mL/min,柱溫35 ℃不變,保留時間上下浮動0.3 min以內(nèi)。改變柱溫33、38 ℃,流速0.35 mL/min不變,保留時間上下浮動0.3 min以內(nèi),均能達(dá)到良好的分離度和精確的含量測定結(jié)果。色譜柱性能穩(wěn)定,適合本項目頭孢噻呋含量的測定。最終選擇292 nm作為檢測波長,35 ℃柱溫,保留時間約為5.05 min。

        3.2 本方法與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的進(jìn)口質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]方法的對比 本實驗分別采用建立的超高效液相色譜方法和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的高效液相色譜方法,對獸藥企業(yè)生產(chǎn)的頭孢噻呋晶體注射液進(jìn)行含量測定,測得頭孢噻呋晶體注射液中頭孢噻呋含量相對偏差均小于1%,說明本試驗建立的超高效液相色譜方法滿足該產(chǎn)品質(zhì)控檢測要求。此外,超高效液相色譜法流速為0.35 mL/min,運行10 min,每個樣品需要消耗3.5 mL流動相;高效液相色譜法流速為1.5 mL/min,運行時間14 min,每個樣品需要消耗21 mL流動相。通過比較,超高效液相色譜法更節(jié)約實驗溶劑等,每個樣品節(jié)省流動相16.5 mL、縮短4 min分析時間,提高了工作效率。

        本實驗建立的超高效液相色譜法,對頭孢噻呋晶體注射液中頭孢噻呋進(jìn)行定性和定量測定,方法快速,可以作為企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)方法,具備精準(zhǔn)快捷、經(jīng)濟環(huán)保的特點,能有效控制頭孢噻呋晶體注射液的質(zhì)量。

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