王磊,楊承槐,劉瑩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

與哺乳動物原代細胞相比，傳代細胞系在生物制品研發(fā)、生產(chǎn)過程中具有突出的優(yōu)勢[1]，已有多種傳代細胞系成功應用于生物制品生產(chǎn)、檢驗的各個環(huán)節(jié)[2]。傳代細胞系自身的特性(諸如染色體特性、致瘤性等)與生物制品的安全性息息相關。因此，國內(nèi)無論是人用還是獸用生物制品法典都明確要求特定的傳代細胞系或二倍體細胞作為疫苗生產(chǎn)用基質(zhì)前，必須對特定代次進行胞核學檢驗[3-4]。細胞染色體制片是胞核學檢驗中的重要環(huán)節(jié)，影響因素較多，對環(huán)境和操作的要求較高，任何一個條件控制不好都會導致細胞染色體分散度差、長度不適于觀察計數(shù)、結果重復性不好，進而影響到后續(xù)的檢驗結果[5-6]。

國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心(國家獸醫(yī)微生物資源平臺)保藏的倉鼠腎細胞(BHK-21)、中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)、豬睪丸細胞系(ST)、羊睪丸細胞系(OA3.Ts)、牛腎細胞系(MDBK)、兔腎細胞系(RK-13)既具有種屬代表性又是生物制品研發(fā)和生產(chǎn)中的常用生產(chǎn)基質(zhì)[7-8]。本研究參考人類羊水細胞以及多種原代細胞的染色體制備方法，對以上6種哺乳動物細胞系的染色體制片條件進行優(yōu)化研究，旨在對鼠源、豬源、羊源、牛源、兔源傳代細胞系的染色體制片提供有益借鑒和參考。

1 材料方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 細胞系 BHK-21細胞第55代，批號20170719；CHO(代次不明)，批號20160721；ST細胞第125代，批號20170621；OA3.Ts細胞第29代，批號20160806；MDBK細胞第9代，批號20170623；RK-13細胞第24代，批號20181130；均來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 秋水仙素(沃凱，批號20171202)配制成100 μg/mL溶液、固定液(甲醇(滬試，批號20170821)：乙酸(國藥集團，批號20161010)=3∶1)、KCl(Vetec，批號wxbc4662v)配制成0.4%(g/V)溶液和0.075 mol/mL溶液、DMEM(Gibco，批號8119416)、胎牛血清(PAN，批號ST170802)、0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco，批號1953147)、0.01 mol/L PBS緩沖溶液(實驗室配制)、吉姆薩染液(Solarbio,批號20161124)。

1.1.3 主要儀器 Leica核型分析系統(tǒng)(型號 CyoVision capture station)、Hettich離心機(型號320R)、Thermo CO2培養(yǎng)箱(型號Heracell 240i)、Nikon倒置顯微鏡(型號TS100)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)條件 分別將凍存管中的CHO、BHK-21、ST、OA3.Ts、MDBK、RK-13六種細胞在37 ℃水浴中融化后，各加入含10 mL DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)的25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 染色體制片 待6種細胞均長成良好單層時，以1∶2比例傳代至相應瓶數(shù)。隨后分別按照以下方法進行制片條件的優(yōu)化(表1)。

表1 染色體制片優(yōu)化條件選擇Tab 1 Selection of optimal conditions for chromosome production

傳代后培養(yǎng)24 h時滴加秋水仙素(終濃度分別為1 μg/mL、4 μg/mL、7.5 μg/mL)處理1 h。隨后吸凈培養(yǎng)液，加1 mL胰酶消化中和后，充分吹散細胞。1 200 r/min離心,8 min收集細胞沉淀。細胞沉淀中加入8 mL KCl低滲液(濃度分別為0.4%和0.075 mol/mL)，將細胞沉淀團塊吹散后室溫處理不同時間(20 min、40 min、60 min)；然后加入3 mL固定液，混勻，1 200 r/min離心8 min，棄掉上清液。重復滴加固定液、離心處理兩次后，重懸于2 mL的固定液中。將固定處理好的細胞滴在-20 ℃預冷的干凈玻片上，干燥后，用Giemsa染色液浸泡8 min，用純化水輕柔沖洗干凈。對分散較好的單個細胞的染色體視野用CytoVision System (Applied Imaging)軟件進行圖像拍攝并統(tǒng)計染色體數(shù)目，共統(tǒng)計50個以上細胞的染色體條數(shù)。

2 結果與分析

本實驗通過對不同細胞在不同秋水仙素濃度、低滲液濃度、低滲液處理時間的條件摸索發(fā)現(xiàn),以上六種細胞系用25 cm2細胞培養(yǎng)瓶傳代后培養(yǎng)24～48 h，1 μg/mL的秋水仙素處理60 min，處在中期分裂相的細胞最多，視野中染色體長度適中，用0.4% KCl溶液低滲處理40 min，細胞中染色體在載玻片上形態(tài)最佳，分散度最好(圖1)。

A：BHK-21細胞；B：CHO細胞；C：MDBK細胞； D：OA3.Ts細胞；E：ST細胞；F：RK-13細胞A：BHK-21 cell;B：CHO cell;C:MDBK cell;D：OA3.Ts cell;E：ST cell;F：RK-13 cell圖1 條件優(yōu)化后的六種傳代細胞系染色體制片效果(100倍油鏡觀察)Fig 1 Chromosome slicing effect of optimized six cell lines (100-fold oil microscopic observation)

鏡下觀察六種傳代細胞的染色體的形態(tài)和結構，高倍鏡下挑選50 個以上染色體輪廓清晰分散良好的處于中期細胞，精確計數(shù)每個細胞的染色體數(shù)，通過統(tǒng)計確定六種細胞眾數(shù)結果(表2)。

表2 六種細胞染色體條數(shù)統(tǒng)計結果Tab 2 Mode number of chromosomes of six cell lines

3 討論與結論

由于細胞染色體的核型作為一種特異性的細胞遺傳信息很好地表現(xiàn)出自身的種質(zhì)特性[1]，因此胞核學檢驗通過染色體核型檢查可以清楚地反映細胞系的遺傳背景和傳代的穩(wěn)定性(傳代過程中的染色體是否發(fā)生畸變或者缺失等情況)[9]。研究發(fā)現(xiàn)：ST細胞眾數(shù)與豬源原代細胞染色體眾數(shù)(2n=38)一致，占細胞總數(shù)的67.1%，說明該細胞系染色體分布頻率在正常二倍體細胞附近；其他五種細胞的眾數(shù)與其對應原代細胞相比，均有不同程度的偏差，并且染色體的數(shù)量分布也較為離散。張德禮等認為細胞的致瘤性與否和細胞系染色體的變異情況直接相關，細胞系染色體的眾數(shù)與原代細胞相比偏離的越高、染色體數(shù)目范圍越寬，出現(xiàn)致瘤性的幾率就越大[10-12]。

細胞染色體制片質(zhì)量的好壞會直接影響胞核學檢驗的準確性和檢驗效率[13]。秋水仙素的處理對染色體的形態(tài)和處于中期分裂相的數(shù)量起到了關鍵作用。秋水仙素具有細胞毒性，會抑制細胞生長，促進細胞凋亡，導致染色體分裂抑制，形態(tài)變異[14]。本研究參考相關文獻[5,7]，結合細胞染色體制備經(jīng)驗，對秋水仙素的濃度進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用終濃度為1 μg/mL的秋水仙素處理后，細胞染色體臂長適中并且形態(tài)最佳；秋水仙素的濃度過高或時間較長，染色體會呈“點”狀(圖2B)，導致后續(xù)G帶顯色分析時帶型無法分辨；秋水仙素濃度過低或處理時間過短，染色體會因為長度過長而糾纏在一起(圖2C)，也影響后續(xù)的結果分析。秋水仙素處理細胞的時機亦會影響到染色體的形態(tài)以及長度。秋水仙素處理的時機應盡量選擇在細胞系傳代后24～48 h，細胞生長90%至剛剛長滿細胞瓶時。錯誤的處理時間可能會導致處于中期分裂相的細胞過少，或者滴片后細胞染色體的分散度不好呈“菊花”狀(圖2A)。

滴片后染色體的分散程度常與低滲液的處理是否合適有關。常見的低滲溶液包括KCl溶液、檸檬酸鈉溶液或者氯化鈉溶液[15-16]。0.075 mol/mL的KCl溶液作用20～60 min多用于傳代細胞系和羊水細胞的低滲處理[13,17]。為了嘗試在低滲過程中使細胞膨脹更加充分，在滴片后得到最佳的染色體分散效果，本研究增加了1組濃度更低的低滲液(0.4% KCl)處理。結果表明，待檢細胞用0.4% KCl溶液在37 ℃水浴中處理40 min時的低滲效果最佳，細胞滴片后染色體分散適中，破碎釋放染色體的細胞視野較多。而采用濃度過低的低滲液或者處理時間過長會導致細胞在滴片前就提前破碎，滴片后視野背景中會出現(xiàn)大量游離的染色體。采用濃度過高的低滲液或者低滲液處理時間過短會造成等滲的效果，在滴片后沒有細胞破碎釋放出染色體(圖2D)，得不到理想的染色體中期分裂相視野。

除以上涉及的影響因素外，細胞的培養(yǎng)狀態(tài)、傳代比例甚至是滴片時的溫濕度條件和載玻片的質(zhì)量亦會對制片效果產(chǎn)生很重要的影響。胞核學檢驗是一個很經(jīng)典的實驗方法，如何將染色體制片的過程標準化，滿足多種屬細胞檢驗需求，是今后下一步的努力方向。

A.染色體呈“菊花狀”(ST細胞)；B.染色體呈“點狀”(OA3.Ts細胞)；C.染色體長度過長(MDBK細胞)；D.染色體分散度差(OA3.Ts細胞)A.The chromosome is “chrysanthemum like” (ST cell);B.The chromosome is “punctate”(OA3.Ts細胞);C.Chromosome length is too long(MDBK cell);D.Poor chromosome dispersion(OA3.Ts cell)圖2 染色體制片過程中的常見問題Fig 2 Common problems in chromosome production