王雪純

（西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224）

多倍體是指體細(xì)胞中存在3 個(gè)或3 個(gè)以上染色體組的個(gè)體，根據(jù)基因組復(fù)制的結(jié)果分為異源多倍體和同源多倍體[1]。多倍體育種是指通過(guò)染色體加倍選育新品種或新種質(zhì)[2]。多倍體除了自然發(fā)生外，也可以通過(guò)人工方式誘導(dǎo)。常見(jiàn)的方式是物理和化學(xué)方式。物理方式有溫度激變、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射等。化學(xué)誘導(dǎo)以N-亞硝基-二甲脲和秋水仙素效果最好[3]。

多倍體加強(qiáng)了植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力，如抗旱、抗鹽、抗病蟲(chóng)害等。蠶豆（Vicia faba），別名南豆、胡豆等，屬于豆科（Fabaceae）野豌豆屬（Vicia），一年生或越年生草本植物[4]。蠶豆是世界上第三大重要的冬季食用豆作物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，蛋白質(zhì)含量為25%～35%，還富含糖、礦物質(zhì)、維他命、鈣和鐵。此外，作為固氮作物，蠶豆可以將自然界中分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氮素化合物，增加土壤氮素含量[5]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地選擇在西南林業(yè)大學(xué)苗圃，位于云南省昆明市盤(pán)龍區(qū)，屬亞熱帶半濕潤(rùn)高原季風(fēng)氣候，全年無(wú)霜期較長(zhǎng)，海拔約1 950 m，年平均氣溫約14.7℃，絕對(duì)最低氣溫-9℃，四季溫差小，雨水較為充足，5—10 月是雨季，11 月至翌年4 月是干季，年降水量700～1 100 mm，年平均相對(duì)濕度68.2%，全年降水量在時(shí)間分布上干濕分明，土壤為酸性土壤。

1.2 試驗(yàn)材料

以蠶豆種子（2n=12）為試驗(yàn)材料，準(zhǔn)備120 顆蠶豆種子進(jìn)行沖洗，將清洗好的蠶豆種子放置于清水中，在室溫條件下浸泡24 h，浸泡結(jié)束后，將120 顆蠶豆種子平均分為4 組，每組30 顆，分別放入4 個(gè)培養(yǎng)皿中，擺放整齊后，使用不同濃度的秋水仙素（0.01%、0.05%、0.10%），清水作為對(duì)照，分別滴至4 個(gè)培養(yǎng)皿中的蠶豆胚根上，在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，秋水仙素處理24 h 后，將蠶豆上的秋水仙素沖洗干凈，分為4 組并做好標(biāo)記，分裝至4 個(gè)穴盤(pán)，將穴盤(pán)標(biāo)號(hào)，用相同基質(zhì)培育種子，而后放置空地處培養(yǎng)，加防護(hù)膜防止陽(yáng)光暴曬及鳥(niǎo)類、動(dòng)物危害種子發(fā)育。及時(shí)觀察，對(duì)干旱缺水穴盤(pán)及時(shí)澆水。

1.3 方法

1.3.1形態(tài)測(cè)量。在培育20 d 后，將蠶豆苗挖出，在挖取過(guò)程中，注意保護(hù)蠶豆根部。對(duì)蠶豆苗高、地徑、根數(shù)、主根長(zhǎng)、主根粗、側(cè)根長(zhǎng)等進(jìn)行測(cè)定，使用電子游標(biāo)卡尺對(duì)其地徑、主根粗進(jìn)行測(cè)量，采用直尺測(cè)定其苗高、主根長(zhǎng)、側(cè)根長(zhǎng)，同時(shí)嚴(yán)格記錄所測(cè)數(shù)據(jù)，地徑數(shù)據(jù)精確到0.01 mm，苗高數(shù)據(jù)精確到0.1 cm。

1.3.2染色體觀察前處理。將蠶豆苗上的泥土沖洗干凈，分別切出4 組蠶豆苗幼嫩根尖（1 cm），每個(gè)處理50 根并分別放入4 瓶裝有蒸餾水的錐形瓶中，清洗過(guò)后迅速放入濃度為0.10%的秋水仙素溶液與0.02 mol/L 8-羥基喹啉等體積混合液中預(yù)處理3 h。之后，用90%乙醇和70%乙醇清洗片刻立即取出，用蒸餾水清洗3 次，用卡諾固定液固定放置于4℃冰箱24 h。24 h 后用乙醇清洗片刻置于75%酒精中待用，用蒸餾水清洗3次后將根尖組織分別放入1 mol/L HCL溶液中解離23 min。解離后立即取出放置盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行染色。用染色液染色6 min 后，將其制成臨時(shí)玻片，敲打蓋玻片至細(xì)胞均勻分散，進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 軟件和Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，發(fā)芽率（%）=發(fā)芽數(shù)量（顆）/處理總數(shù)（顆）×100，每組處理總數(shù)都為30 顆。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素處理下的蠶豆發(fā)芽率

從圖1 可以看出，0.01%秋水仙素處理下蠶豆的發(fā)芽率最高，為80.00%，清水和0.10%秋水仙素處理下發(fā)芽率最低?！?.01%濃度呈現(xiàn)處理濃度與發(fā)芽率成正比關(guān)系，≥0.01%呈現(xiàn)處理濃度與發(fā)芽率成反比關(guān)系。大于0.01%秋水仙素濃度對(duì)蠶豆的發(fā)芽率產(chǎn)生不同程度抑制，隨著濃度提高，蠶豆種子發(fā)芽率下降，可能是由于高濃度的秋水仙素對(duì)蠶豆種子產(chǎn)生毒害作用。該試驗(yàn)秋水仙素處理時(shí)間均為24 h，可以看出0.01%秋水仙素有助于蠶豆種子萌發(fā)，過(guò)高濃度的秋水仙素會(huì)導(dǎo)致種子發(fā)芽率降低。

圖1 不同濃度秋水仙素處理對(duì)蠶豆發(fā)芽率的影響

2.2 不同濃度秋水仙素處理下的蠶豆形態(tài)結(jié)構(gòu)

從表1 可以看出，以地徑看，0.01%秋水仙素處理下的蠶豆苗地徑為2.080～4.510 mm；0.05%處理下蠶豆苗地徑為0.900～8.730 mm，范圍相差較大；0.10%處理下蠶豆苗地徑為1.400～2.750 mm；CK 的蠶豆地徑為2.660～4.020 mm。分析可知，20 d 蠶豆苗地徑最大值及最小值均為秋水仙素0.05%處理，蠶豆平均地徑值從大到小依次為：CK＞0.01%＞0.10%；從變異系數(shù)分析可知，0.05%秋水仙素處理下，蠶豆苗地徑變異系數(shù)最高為65.63%，表明此濃度處理下蠶豆苗地徑變化較大，具不穩(wěn)定性，存在較大可利用價(jià)值，CK 地徑變異系數(shù)最低，說(shuō)明其在生長(zhǎng)過(guò)程中較穩(wěn)定。

表1 蠶豆形態(tài)結(jié)構(gòu)描述性統(tǒng)計(jì)

分析苗高可知，0.05%秋水仙素處理下的平均苗高最大，達(dá)7.67 cm，其次為0.01%秋水仙素處理，0.10%秋水仙素處理的苗高均值最小。變異系數(shù)最高的為0.01%秋水仙素處理，最低的為0.10%秋水仙素處理，變異系數(shù)小于CK，可見(jiàn)低濃度秋水仙素較易引起蠶豆苗高變異。

主根長(zhǎng)結(jié)果顯示，平均主根長(zhǎng)度最大值為0.01%秋水仙素處理，達(dá)6.18 cm，高于CK，最小值為0.10%秋水仙素處理，為4.22 cm，與0.05%秋水仙素處理均低于CK。0.01%秋水仙素處理變異系數(shù)最低，為31.93%。

主根粗結(jié)果顯示，主根粗的平均值從大到小依次為：0.01%＞CK＞0.10%＞0.05%；0.01%秋水仙素處理主根粗為1.060～6.620 mm；0.05%處理主根粗為0.000～1.330 mm；0.10%處理主根粗為0.500～1.810 mm；CK 處理主根粗為1.560～2.850 mm;主根粗的變異系數(shù)從大到小依次為0.05%＞0.10%＞0.01%＞CK。

側(cè)根平均長(zhǎng)度大小關(guān)系為：0.05%秋水仙素處理下的蠶豆苗側(cè)根最長(zhǎng)，達(dá)6.87 cm，其次為0.01%秋水仙素處理，最短的為0.10%秋水仙素處理。側(cè)根長(zhǎng)變異系數(shù)大小關(guān)系依次為CK＞0.10%＞0.05%＞0.01%，可見(jiàn)秋水仙素處理對(duì)側(cè)根長(zhǎng)的影響不大，均小于CK；由于側(cè)根粗度不好直接測(cè)量，因此采用多次測(cè)量求平均值的方法，結(jié)果可知，平均側(cè)根粗度大小關(guān)系均表現(xiàn)為：0.01%＞CK＞0.10%＞0.05%，可知低濃度秋水仙素處理下蠶豆苗側(cè)根較粗；變異系數(shù)大小關(guān)系為：0.05%秋水仙素處理下側(cè)根粗變異系數(shù)最高；CK 側(cè)根粗變異系數(shù)最低，可見(jiàn)適當(dāng)?shù)那锼伤乜蓪?dǎo)致側(cè)根增粗。

2.3 不同濃度秋水仙素處理下的蠶豆根尖細(xì)胞染色體

對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞進(jìn)行染色體觀察（圖2），不同濃度秋水仙素處理，染色體出現(xiàn)多倍化現(xiàn)象。在蠶豆正常二倍體（2n=12）上，出現(xiàn)四倍體（2n=24）細(xì)胞，但未觀察到異形染色體的變化，除發(fā)生倍性變化，染色體結(jié)構(gòu)特征與二倍體一致。

圖2 不同濃度秋水仙素處理下的蠶豆根尖細(xì)胞染色體

3 結(jié)論與討論

秋水仙素處理植物材料時(shí)，其效果隨濃度、處理時(shí)間、材料的不同而不同[6]，研究結(jié)果也不盡相同[7]。不同濃度秋水仙素處理蠶豆種子，結(jié)果表明，≤0.01%濃度秋水仙素對(duì)蠶豆發(fā)芽具有促進(jìn)作用，而0.05%～0.10%秋水仙素濃度與發(fā)芽率呈反比關(guān)系，這可能與秋水仙素具有毒害作用有關(guān)，這與范國(guó)強(qiáng)等[8]的研究結(jié)果相似，秋水仙素作為一種劇毒化學(xué)誘變劑在對(duì)細(xì)胞染色體加倍的同時(shí)還對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，濃度越大造成的傷害越大。

秋水仙素對(duì)蠶豆苗形態(tài)特征影響較大，其中地徑平均長(zhǎng)度表現(xiàn)為CK＞0.01%＞0.05%＞0.10%；施加秋水仙素會(huì)導(dǎo)致蠶豆苗地徑生長(zhǎng)長(zhǎng)度降低，這與朱夢(mèng)鑫等[9]利用秋水仙素研究蒲公英生長(zhǎng)特性的結(jié)果相似。對(duì)平均苗高的影響為0.05%＞0.01%＞CK＞0.10%，說(shuō)明低濃度秋水仙素有助于苗高生長(zhǎng)，這與儲(chǔ)博彥等[10]利用秋水仙素對(duì)絲棉木種子及幼苗的研究結(jié)果一致。主根長(zhǎng)受秋水仙素影響大小關(guān)系為0.01%＞CK＞0.05%＞0.10%，說(shuō)明低濃度秋水仙素有助于主根生長(zhǎng)；主根粗的均值大小關(guān)系對(duì)應(yīng)秋水仙素濃度依次為0.01%＞CK＞0.10%＞0.05%，說(shuō)明低濃度秋水仙素有助于主根生長(zhǎng)發(fā)育，這與閆秋潔等[11]及李光明等[12]研究結(jié)果相似。側(cè)根平均長(zhǎng)度大小關(guān)系為0.05%＞0.01%＞CK＞0.10%，平均側(cè)根粗度大小關(guān)系為0.01%＞CK＞0.10%＞0.05%，可見(jiàn)低濃度秋水仙素有利于側(cè)根的生長(zhǎng)，這與王曉雯等[13]研究結(jié)果不一致。這可能與秋水仙素的處理時(shí)間有關(guān)。該試驗(yàn)沒(méi)有探討秋水仙素的處理時(shí)間與其生長(zhǎng)發(fā)育、多倍體等的關(guān)系，可以進(jìn)一步探討秋水仙素處理濃度細(xì)化以及處理時(shí)間對(duì)蠶豆的影響。