楊亞飛

（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

膠原蛋白片的毒理安全性研究

楊亞飛

（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

為判定膠原蛋白片是否會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，進(jìn)行了膠原蛋白片的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)。采用急性毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)、微小鼠精子畸形試驗(yàn)和30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)膠原蛋白片的急性毒性、致突變性及亞慢性毒性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：膠原蛋白片小鼠急性毒性試驗(yàn)大于20 000mg/kg，屬實(shí)際無(wú)毒；對(duì)基因、體細(xì)胞與生殖細(xì)胞無(wú)明顯致突作用；分別按1.88、3.75、7.5g/kg的劑量用受試物喂養(yǎng)大鼠30d，結(jié)果表明動(dòng)物未出現(xiàn)異常。

膠原蛋白片；急性毒性；微核；精子畸形；Ames試驗(yàn)

膠原蛋白片是以膠原蛋白粉、天然VE為主要原料，用以增強(qiáng)免疫力的保健食品。免疫是指機(jī)體狻觸“抗原性異物”或“異己成分”的一種特異性生理反應(yīng)[1]。免疫系統(tǒng)對(duì)維持機(jī)體正常生理功能具有重要意義。當(dāng)人體營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入不足（蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等缺乏）時(shí)會(huì)造成機(jī)體抵抗力下降，導(dǎo)致免疫活性降低，對(duì)免疫機(jī)制產(chǎn)生不良影響[2]。免疫活性的變化也影響其他器官的功能，如感染、癌癥[3]、各類的慢性病、失眠癥、抑郁癥、慢性疲勞、以及免疫復(fù)合病等等[4-5]。膠原蛋白片是一種以提高免疫力為主要功效的保健食品。為了研究其安全性，特對(duì)其毒理安全性進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

膠原蛋白片為白色至淡黃色片劑。人體推薦量為每日4.5 g/60 kg。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)條件

清潔級(jí)ICR小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2007－0005，體重19 g～35 g，由上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2007－0008，動(dòng)物飼料由蘇州雙獅試驗(yàn)動(dòng)物飲料科技服務(wù)有限公司提供，登記證號(hào)：蘇E飼生字審（2002）006。

1.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)

選用體重為19 g～22 g的昆明種小鼠20只，雌雄各半，分放于兩鼠籠內(nèi)，同性別小鼠之間體重之差不超過(guò)3 g。采用最大耐受量法將受試樣品對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)口灌胃染毒，灌胃容量按每次0.4mL/20 g體重計(jì)。24 h內(nèi)2次對(duì)小鼠灌胃，灌胃間隔時(shí)間為6 h。染毒后，觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、體重變化、中毒癥狀和死亡情況等，觀察期為2周。試驗(yàn)?zāi)┰俅螌?duì)動(dòng)物稱重，對(duì)死亡動(dòng)物及到期處死動(dòng)物進(jìn)行尸體解剖，肉眼觀察大體病理改變情況。

1.4 遺傳毒性試驗(yàn)

1.4.1 Ames試驗(yàn)

測(cè)試菌株：TA97、TA98、TA100、TA102由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)生物化學(xué)系提供，經(jīng)鑒定測(cè)試菌株生物學(xué)特性符合標(biāo)準(zhǔn)要求。釆用平板摻入法，測(cè)試劑量為8、40、200、1 000、5 000μg/皿。樣品處理方法為：取經(jīng)121℃高壓20min滅菌處理后的樣品2.5 g加無(wú)菌蒸餾水至20mL混勻，緩慢加入經(jīng)預(yù)處理好的XAD-II樹(shù)脂柱，以20mL/h的流速進(jìn)行吸附，以去除組氨酸，而后用洗耳球吹入空氣以驅(qū)走水分，加入重蒸餾的丙酮50mL，以20mL/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。洗脫液經(jīng)60℃揮發(fā)盡丙酮后，加入DMSO 50mL混勻，此收集液中的樣品含量即為50mg/mL。取收集液依次用DMS0按1∶4稀釋，取得各測(cè)試劑量組受試物?！侗墒称窓z驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)中平板摻入法，在保溫的45℃2mL頂層培養(yǎng)基中，依次加入0.1mL受試物、0.1mL菌株增菌液，需活化時(shí)加入0.5mLS9混合液，充分混勻迅速傾倒底層平板，做3個(gè)平行平板。37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)回變菌落數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)一次。

1.4.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

試驗(yàn)選用清潔級(jí)昆明種小鼠50只，體重：25 g～30 g，雌雄各半。將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別作為樣品高中低3個(gè)劑量組（2.5、5、10 g/kg）及陰性對(duì)照組（蒸餾水20 g/kg）和陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg）。釆用30 h兩次灌胃法，將配制的不同濃度樣品按0.4mL/20 g，分別對(duì)各組動(dòng)物灌胃。于第二次灌胃后6 h，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取股骨骨髓加小牛血清混勻，常規(guī)涂片、固定，Giemsa.染色制片。鏡撿觀察，每鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）的微核數(shù)，微核率以千分率表示，在計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞（計(jì)數(shù)200個(gè)PCE）時(shí)同時(shí)計(jì)數(shù)成熟紅細(xì)胞（MCE）數(shù)，并計(jì)算PCE/ NCE值，用spss11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

雄性昆明種小鼠25只，體重：25 g～35 g。將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組5只，分別作為樣品高中低3個(gè)劑量組（2.5、5、10g/kg）及陰性對(duì)照組（蒸餾水20g/kg）和陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40mg/kg）。將配制的不同濃度樣品按0.4mL/20 g分別對(duì)各組動(dòng)物灌胃。每日1次，連續(xù)5 d。于首次給樣后第35天，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取二側(cè)副睪放入生理鹽水中，剪碎，四層過(guò)濾，取濾液涂片，固定，2%伊紅染色制片。鏡檢觀察，每鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子的畸形數(shù)，計(jì)算精子畸形發(fā)生率，并用spss11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

1.5.1 劑量組選擇與受試物給予方式

SD大白鼠80只，雌雄各半，體重60 g～80 g將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半，分別作為祥品3個(gè)劑量組（1.88、3.75、7.5 g/kg，相當(dāng)于人體推薦劑量的25、50、100倍），另設(shè)空白對(duì)照組，連續(xù)喂養(yǎng)30 d。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)要求及動(dòng)物飼料攝入情況（約10 g/100 gBW/d），分別將樣品281、563、1 125 g摻入飼料至15 kg，拌勻，經(jīng)飼料機(jī)制成顆粒飼料，即成低、中、高三種不同樣品含量的飼料，分別給三組動(dòng)物喂飼。空白對(duì)照組給予不含樣品的同種飼料。在高劑量組飼料中摻入樣品達(dá)7.5%，根據(jù)受試蛋白含量調(diào)整高劑量組飼料蛋白質(zhì)含量與對(duì)照組飼料一致為20%?？瞻讓?duì)照組給予不含樣品的基礎(chǔ)飼料。

1.5.2 觀察指標(biāo)

1）一般情況每天觀察動(dòng)物1次。

2）體重生長(zhǎng)情況每周稱重1次。

3）飲料消耗及利用率每周添加飲料2次，稱重并記錄，同時(shí)記錄散失的飲料量。

4）血液學(xué)檢查于試驗(yàn)第30天股動(dòng)脈以血進(jìn)行血紅蛋白的測(cè)定，紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及白細(xì)胞分類測(cè)定。

5）血液生化檢查于試驗(yàn)第30天股動(dòng)脈取血，分離血清，使用日立－7150全自動(dòng)生化儀進(jìn)行總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、葡萄糖（GLU）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）、膽固醇（T－CHE）及甘油三酯（TG）的測(cè)定。

6）臟器重量及病理組織學(xué)檢查試驗(yàn)結(jié)束后，采用股動(dòng)脈放血處死大鼠，立即解剖進(jìn)行大體檢查。稱取肝、脾、雙側(cè)腎和睪丸，分別計(jì)算臟體比；以甲醛液固定肝、腎、十二指腸、卵巢、睪丸。石蠟包埋切片，H.E染色后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

試驗(yàn)期間各組動(dòng)物活動(dòng)正常，毛色光澤度好，未見(jiàn)任何中毒癥狀和死亡，到期處死動(dòng)物，大體解剖肉眼觀察各臟器情況，未見(jiàn)異常。膠原蛋白片對(duì)雌雄小白鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的最大耐受劑量MTD均大于20 000mg/kg。根據(jù)急性毒性（LD50）劑量的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，膠原蛋白片屬無(wú)毒級(jí)。

表1 雌雄小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果Table1 Resuts of acute toxcity to male&female mice by oral administration

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 Ames試驗(yàn)

在本實(shí)驗(yàn)條件下的二次試驗(yàn)中，受試物每皿8μg至5 000μg，在加與不加S9活化系統(tǒng)平板摻入法檢測(cè)的回復(fù)菌落數(shù)小于溶劑對(duì)照的2倍，也未呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，樣品Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。即膠原蛋白片未見(jiàn)致突變作用。兩次試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表2、表3。

表2 Ames試驗(yàn)第一次測(cè)試結(jié)果Table2 The results of the first Ames test

表3 Ames試驗(yàn)第二次測(cè)試結(jié)果Table3 The results of the second Ames test

2.2.2 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，見(jiàn)表4。

結(jié)果表明，試驗(yàn)組小鼠在各試驗(yàn)劑量下嗜多染紅細(xì)胞（PCE）微核出現(xiàn)率、PCE/成熟紅細(xì)胞與陰性對(duì)照組之間的差異均不顯著，而陽(yáng)性對(duì)照組表現(xiàn)出強(qiáng)烈的致突變作用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，膠原蛋白片未見(jiàn)致突變作用。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

小鼠精子畸形試驗(yàn)，見(jiàn)表5。

由表5可知，各劑量組小鼠的精子畸形發(fā)生率在正常范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺組）與陰性對(duì)照組之間的差異極顯著（P＜0.01）。

表4 動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率Table4 The incidence of polychromatic crythrocyte micronucleus of animals'marrow

表5 膠原蛋白片對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率的影響Table5 The influence of collagen tablets on the incidence of the sperm deformity of mice

注：**表示與陰性對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01）。

2.3 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

2.3.1 一般情況

整個(gè)喂養(yǎng)期間，小鼠毛色正常，未見(jiàn)行為異常，無(wú)死亡發(fā)生。

2.3.2 食物利用率

以每100克飼料的大鼠增重克數(shù)計(jì)算食物利用率。由表6可知，各劑量組動(dòng)物食物利用率與同性別對(duì)照組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表6 膠原蛋白片30天喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠總食物利用率的影響Table6 The effect of collagen tablets on the food utilization rate in the30 days feeding study

2.3.3 血常規(guī)及血生化指標(biāo)

血常規(guī)及血生化指標(biāo)，見(jiàn)表7、表8。

表7 膠原蛋白片30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果Table7 The results of collagen tablets on the blood test of the rats in the30 days feeding study

表8 膠原蛋白片30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)大鼠的血清生化檢驗(yàn)結(jié)果Table8 The results of collagen tablets on the Serum biochemical test in the30 days feeding study

由表7、表8可知，樣品分別按高、中、低劑量給予各組大鼠30 d，對(duì)照組和各劑量組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類均在正常值范圍內(nèi)。對(duì)照組和各劑量組的各項(xiàng)生化指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)。用SPSS11.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析：樣品各劑量組與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.4 臟體比

臟體比見(jiàn)表9。

表9 膠原蛋白片30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠臟體比的影響Table9 The effet of collagen tablets on the Organ/body weight ratio in the30 days feeding study

由表9可知，各組的臟器絕對(duì)重量及其肝重/體重、脾重/體重、腎重/體重、睪丸重/體重比與對(duì)照組相比未見(jiàn)異常。

2.3.5 大體解剖及組織學(xué)檢查結(jié)果

1）大體解剖檢查樣品喂養(yǎng)30 d后，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察各組動(dòng)物臟器未發(fā)現(xiàn)明顯病變。

2）病理組織學(xué)檢查，僅選高劑量組及正常對(duì)照組（每組20只，雌雄各半）作組織病理學(xué)檢查。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)下：①肝臟：對(duì)照組雌鼠見(jiàn)1例肝細(xì)胞輕度空泡變性、1例匯管區(qū)炎癥細(xì)胞輕度浸潤(rùn)。雄鼠見(jiàn).1例肝細(xì)胞輕度空泡變性、1例匯管區(qū)炎癥細(xì)胞輕度浸潤(rùn)。高劑量組雌鼠見(jiàn).2例有少量肝細(xì)胞嗜酸性變。雄鼠見(jiàn)2例肝細(xì)胞輕度空泡變性、1例肝細(xì)胞周?chē)倭垦准?xì)胞浸潤(rùn)、1例肝細(xì)胞輕度嗜酸性變、1例匯管區(qū)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。②腎臟：對(duì)照組雌鼠腎皮質(zhì)部見(jiàn)4例腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹、1例上皮細(xì)胞輕度空泡變性、2例腎小管管腔內(nèi)少量管型，以及腎髓質(zhì)部1例曲細(xì)精管中少量管型、1例間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。雄鼠腎皮質(zhì)部有2例腎小管管腔內(nèi)少量管型。高劑量組雌鼠腎皮質(zhì)部見(jiàn)3例腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹、2例輕度空泡變性、3例腎小管管腔內(nèi)少量管型，以及腎髓質(zhì)部1例間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。雄鼠腎皮質(zhì)部見(jiàn)3例腎小管管腔內(nèi)少量管型，以及腎髓質(zhì)部1例曲細(xì)精管中少量管型。③脾臟：對(duì)照組雌鼠脾臟未見(jiàn)異常，雄鼠3例脾臟紅髓輕度擴(kuò)張。高劑量組見(jiàn)雌鼠2例、雄鼠3例脾臟紅髓輕度擴(kuò)張。此外雌鼠還有1例造血細(xì)胞輕度增生。④胃腸：對(duì)照組雌鼠見(jiàn)胃黏膜下3例輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)。雄鼠2例黏膜下少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、以及1例輕度水腫。高劑量組雌鼠胃粘膜下分別有3例輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)及水腫。雄鼠1例黏膜下少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。⑤睪丸：對(duì)照組雄鼠睪丸可見(jiàn)3例間質(zhì)輕度水腫。高劑量組有1例間質(zhì)輕度水腫。⑥卵巢：對(duì)照組與高劑量組雌鼠均有1例卵巢輕度囊腫改變，而且高劑量組還有1例少量卵巢細(xì)胞變性。

3 小結(jié)

研究結(jié)果表明，膠原蛋白片小鼠經(jīng)口LD50＞20.0 g/（kg·bw），屬實(shí)際無(wú)毒；對(duì)基因、體細(xì)胞及生殖細(xì)胞無(wú)明顯致突作用；受試物分別按照高、中、低劑量喂養(yǎng)大鼠30天，結(jié)果表明試驗(yàn)期間動(dòng)物未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，動(dòng)物生長(zhǎng)活動(dòng)正常，皮毛濃密有光澤。各劑量組動(dòng)物體重、食物利用率、主要臟體比與對(duì)照組差異不顯著。對(duì)照組和各劑量組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白及各項(xiàng)生化指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)。大體解剖及組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)該受試物對(duì)各劑量組被檢動(dòng)物的受檢臟器產(chǎn)生有意義的病理變化。

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Toxicological Safety Assessment on Collagen Tablet

YANG Ya-fei
（By-health Incorporated Company，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

The toxicological safety assessment on collagen tablets was carried out in order to judge whether they do harm on human body.The acute toxicity，mutagenicity and subchronic toxicity were studied by using acute toxicity test，Ames test，mice marrow micronucleus experiment，mice sperm malformation experiment and 30-days feeding test.Results showed that the LD50 of acute toxicity test was over 20 000 mg/kg which signified harmlessness of the collagen tablets.

collagen talets；acute toxicity；micronucleus；sperm deformity；Ames test

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.030

2013-05-26

楊亞飛（1979—），女（漢），碩士研究生，研究方向：藥劑學(xué)。