陳瀅如，朱 江，苑鴻雯，舒福政，馬良宵，任曉暄

（北京中醫(yī)藥大學(xué)推拿針灸學(xué)院，北京 100029）

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，實驗研究在基礎(chǔ)部門及臨床科室中均得到了廣泛的開展，孕鼠及胎鼠在生殖生物學(xué)及胚胎學(xué)相關(guān)實驗研究中運用廣泛。有研究者［1］曾對合籠后大鼠是否受孕所采用的托盤陰栓觀察法和陰道涂片精子檢查法進(jìn)行了比較，但對大鼠合籠方法（篩選性周期合籠或自由合籠）未提及；何氏等［2］通過研究認(rèn)為根據(jù)陰道圖片判斷各雌鼠所處的性周期階段，安排處于動情前期或動情期的雌鼠進(jìn)行交配與普通自由交配組比較能夠有效提高整體受孕速度，但未對兩種方法在雌鼠受孕率方面進(jìn)行比較。筆者以晚孕大鼠為研究對象，需準(zhǔn)確掌握大鼠的妊娠天數(shù)，同時以減少可能對大鼠造成影響的人為干預(yù)為重要關(guān)注內(nèi)容，以盡可能的減少對大鼠的刺激和影響。雖然何氏等［2］的研究認(rèn)為陰道涂片篩選性周期交配組在提高整體受孕方面優(yōu)于普通自由交配組，但考慮到其未對受孕率進(jìn)行比較，以及陰道涂片對于大鼠而言確實是一種較強烈的人為刺激，可能會對大鼠造成隱在未知的影響，因此我們從大鼠受孕率和受孕速度方面對制備大鼠妊娠模型的兩種不同合籠方法進(jìn)行了比較。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選用成年SD大鼠，清潔級，性成熟未交配（大鼠性成熟6～8周，體成熟12～16周［3］），雌性26只，體重210～220g，周齡8周，雄性8只，體重240～300g，周齡8周，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供（編號：0024631）。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度20℃±1℃，濕度45％±5％，日光燈光照，普通清潔級鼠飼料自由采食飼養(yǎng)，自由飲用自來水。

1.1.2 器材：普通光學(xué)顯微鏡（日本OLMPUS），載玻片，0.9％生理鹽水，醫(yī)用棉簽。

1.2 方法

1.2.1 雌性大鼠性周期各階段判讀標(biāo)準(zhǔn)［4］：（1）動情前期：持續(xù)時間17～21h，涂片可見大量有核上皮細(xì)胞、少量角化上皮細(xì)胞；（2）動情期：持續(xù)時間9～15h，涂片可見滿視野角化上皮細(xì)胞、少量有核上皮細(xì)胞；（3）動情后期：持續(xù)時間10～14h，涂片可見角化上皮細(xì)胞及白細(xì)胞；（4）動情間期：持續(xù)時間60～70h，涂片可見大量白細(xì)胞及少量黏液。

1.2.2 陰道涂片：每天上午8：00開始，取待檢查雌鼠，一手拇指和食指捏壓住頸部，掌根部壓于腰背部限制活動，另一手翻起尾巴露出陰道口，用沾有生理鹽水的棉簽在陰道口稍作停留以讓雌鼠適應(yīng)，

稍后輕輕插入大鼠陰道病緩慢轉(zhuǎn)動半圈，抽出棉簽并將棉簽上的附著物均勻涂在載玻片上鏡檢（10×10倍）。

1.2.3 受孕判斷：文獻(xiàn)［1］在大鼠孕鼠模型的鑒定中對托盤陰栓檢查法和陰道精子檢查法進(jìn)行過比較，認(rèn)為托盤陰栓觀察法完全可以替代陰道精子檢查法并優(yōu)于精子檢查法。本實驗在實驗初期采用托盤陰栓觀察法作為交配后雌鼠是否受孕的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以托盤中發(fā)現(xiàn)陰栓者判斷為已交配，并記發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)日為受孕第1天；實驗后期（妊娠第20天）采用解剖法判斷雌鼠是否受孕。

1.2.4 實驗分組：隨機分為陰道涂片性周期篩選合籠交配組（簡稱涂片組）和普通自由合籠交配組（簡稱自由組）。涂片組，經(jīng)陰道涂片篩選出處于動情期雌鼠，按體重排序，采用隨機數(shù)字表［5］法進(jìn)行隨機分組，雌雄1：1［6］，于每日19：00～19：30隨機合籠，于合籠后第1天（合籠當(dāng)天記為第0天）、第2天、第3天8：00～8：30、12：00～12：30、19：00～19：30連續(xù)觀察托盤，以發(fā)現(xiàn)陰栓者判斷為已交配，并記當(dāng)日為受孕第1天，另籠飼養(yǎng)；取出合籠第3天未發(fā)現(xiàn)陰栓雌鼠，重新涂片、排序、隨機合籠；連續(xù)合籠3d記為合籠1次，連續(xù)3次合籠未孕雌鼠淘汰。

自由組，雌鼠按體重排序，采用隨機數(shù)字表［5］法進(jìn)行隨機分組，雌雄1：1比例，于每日19：00～19：30隨機合籠，于合籠后第1天（合籠當(dāng)天記為第0天）、第2天、第3天8：00～8：30、12：00～12：30、19：00～19：30連續(xù)觀察托盤，以發(fā)現(xiàn)陰栓者判斷為已交配，并記當(dāng)日為受孕第1天，另籠飼養(yǎng)；取出合籠第3天未發(fā)現(xiàn)陰栓雌鼠，重新排序再次隨機合籠；連續(xù)3次合籠未孕雌鼠淘汰。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)用SAS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計，差異顯著性設(shè)為a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠動情周期中各階段陰道涂片觀察

動情前期陰道涂片：大量不規(guī)則形有核上皮細(xì)胞，偶見少量角化上皮細(xì)胞（圖1）；動情期陰道涂片：大量不規(guī)則形角化上皮細(xì)胞，多成堆積狀互聯(lián)成片（圖2）；動情后期陰道涂片：不規(guī)則角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞均可見（圖3）；動情間期陰道涂片：大量白細(xì)胞、少量有核上皮細(xì)胞、偶見角化上皮細(xì)胞（圖4）。

2.2 涂片過程觀察

涂片前雖然對雌鼠背部進(jìn)行撫摸安撫、將沾有生理鹽水的棉簽在陰道口稍作停留以讓雌鼠適應(yīng)，但從插入棉簽過程中大鼠的抗拒或極力抗拒行為表現(xiàn)來看，陰道涂片方法對雌鼠而言是一種不舒適的、非良性的刺激。

2.3 兩組雌鼠受孕率的比較

涂片組13只雌鼠第1次合籠有9只排栓，孕7只，假孕2只；1只未排栓，受孕；未見栓的3只雌鼠（不包括第1次合籠未見栓受孕雌鼠）繼續(xù)第2次合籠，3只均見栓，均受孕；即涂片組13只雌鼠中，孕11只，其中10只見栓、1只未見栓；2只未孕，但均見栓（未孕的2只雌鼠均為第1次合籠時的見栓雌鼠）。自由組13只雌鼠第1次合籠有11只排栓，孕8只，假孕3只；未見栓的2只雌鼠第2次合籠，2只均見栓，均受孕；即自由組13只雌鼠中，孕10只，10只均見栓；3只未孕，但均見栓（未孕的3只雌鼠均為第1次合籠時的見栓雌鼠）。

在排栓與受孕方面，涂片組13只雌鼠，孕11只，其中10只排栓、1只未排栓；未孕2只，均排栓，為假孕。自由組13只雌鼠，孕10只，10只均排栓；未孕3只，均排栓，為假孕。兩組見栓雌鼠數(shù)量與孕鼠數(shù)量均不一致，均為見栓雌鼠數(shù)量多于受孕雌鼠，且涂片組有1只雌鼠交配未排栓受孕，在第一次托盤檢查時被當(dāng)成未交配雌鼠繼續(xù)合籠，在第2次合籠時發(fā)現(xiàn)陰栓，在分籠飼養(yǎng)后中途產(chǎn)仔8只，經(jīng)計算生產(chǎn)日期與第1次合籠時受孕相符，26只雌鼠中只有此1例交配未排栓受孕雌鼠。

采用Fisher精確概率法對兩種合籠方法的受孕率（涂片組84.6％，自由組76.9％）進(jìn)行比較，兩種合籠方法對受孕率差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 兩組受孕速度的比較

實驗以大鼠合籠次數(shù)（連續(xù)合籠3d記為合籠1次）及對應(yīng)的受孕雌鼠數(shù)量為衡量大鼠受孕速度的指標(biāo)，合籠次數(shù)與受孕速度成反比，實驗中，兩組雌鼠兩次合籠受孕情況如前所述，涂片組13只雌鼠第1次合籠孕8只，自由組13只雌鼠第1次合籠孕8只。涂片組第2次合籠雌鼠3只，孕3只；自由組第2次合籠雌鼠2只，孕2只；由于兩組第2次合籠的數(shù)據(jù)量無法滿足統(tǒng)計要求，故只取第1次合籠的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。

采用Fisher精確概率法對兩種合籠方法的受孕速度進(jìn)行比較，兩種合籠方法對受孕速度差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

實驗中涂片組受孕率84.6％，自由組76.9％，差異不顯著（P＞0.05），即該實驗中陰道涂片篩選性周期在雌鼠受孕率方面并無優(yōu)勢。陰道涂片對雌鼠而言是一種不良刺激，可能會導(dǎo)致雌鼠在隨后的合籠過程中拒絕交配；實驗中雌雄鼠連續(xù)合籠3d記為1次合籠，對自由組雌鼠而言雌雄鼠會同籠飼養(yǎng)3d，從動物飼養(yǎng)角度看雌雄同籠飼養(yǎng)時雄鼠會對雌鼠的動情周期產(chǎn)生影響，誘發(fā)雌鼠進(jìn)入動情期進(jìn)而交配，因此而影響涂片組篩選動情周期的優(yōu)勢得不到體現(xiàn)；實驗樣本量較少，因此也可能對涂片組與自由組在受孕率及受孕速度方面的比較產(chǎn)生影響。

實驗中涂片組雌鼠、自由組雌鼠與雄鼠合籠后，雌鼠的排栓天數(shù)從1d到3d不等，涂片組平均2.2d，自由組平均2.3d，單純從雌鼠排栓使用時間看兩組有差異，該差異是否有意義，以及如果在實驗中限定雌雄鼠合籠時間（天數(shù)），則涂片組在提高整體受孕率及速度方面是否有優(yōu)勢，均需要相關(guān)實驗進(jìn)一步驗證。

實驗中出現(xiàn)的假孕及交配未排栓現(xiàn)象，除了與動物個體差異有關(guān)，還與季節(jié)等因素有關(guān)，動物的繁殖高峰期在春季，本實驗開展正是夏季初中期，雖然動物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的實驗室，但自然界季節(jié)變化的影響亦應(yīng)被考慮。

在以孕鼠或胎鼠為研究對象的實驗中，快速簡便準(zhǔn)確的制備孕鼠模型是保證實驗順利進(jìn)行的首要因素。制備孕鼠模型考慮受孕率的同時，亦應(yīng)對雌鼠的受孕速度予以考慮。

環(huán)境安靜、外界少刺激是制備大鼠受孕模型過程中應(yīng)當(dāng)注意的重要因素［2］，結(jié)合實驗涂片過程中雌鼠因陰道涂片刺激而引起的抗拒行為來分析，認(rèn)為自由合籠交配法制備妊娠模型，可以最大程度減少人為干預(yù)對大鼠造成的刺激和影響，同時當(dāng)動物數(shù)量比較多時，自由合籠交配法亦可以避免繁瑣的涂片操作，減少實驗人員的勞動量。

［1］李彥清，邵龍江，李森，等.大鼠陰栓的實驗觀察和孕鼠模型鑒定方法的比較［J］.中國實驗動物學(xué)雜志，2002，12（1）：17-20.

［2］何秋明，肖尚杰，夏惠敏.大鼠陰道圖片的觀察［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，35（4）：54-56.

［3］軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物場.實驗動物飼養(yǎng)與繁殖［M］.北京：科學(xué)出版社，1984：87-88.

［4］孫敬方.動物實驗方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：424-426.

［5］孫振球.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002，540.

［6］閆晗，何桂林，張曉芳，等.如何提高實驗動物的交配成功率［J］.毒理學(xué)雜志，2007，21（4）：318.