賴福春

【摘 要】定向進(jìn)化是改進(jìn)蛋白功能與活性的有效手段，主要是在實驗室里模擬自然進(jìn)化過程，由易錯PCR、DNA改組、隨機引導(dǎo)重組和交錯延伸技術(shù)等方法進(jìn)行誘變與突變基因體外重組，設(shè)計高通量篩選方法來選出需要的突變株。其對研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重大意義。本文綜述了定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】定向進(jìn)化；易錯PCR；DNA改組；篩選

在20世紀(jì)80年代建立起來的新興學(xué)科——蛋白質(zhì)工程使人類可以根據(jù)已掌握的信息按照自己的意愿和需要改進(jìn)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程最初的目的是：通過對蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計，再通過基因工程的手段，生產(chǎn)出具有更高生物活性或全新的、具有獨特活性的蛋白質(zhì)。但是傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)工程方法（即合理設(shè)計）無法滿足對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行分子改良的要求。面對這種情況，定向進(jìn)化法逐漸受到重視。

蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，是蛋白質(zhì)工程的新策略，是在試管中模擬達(dá)爾文進(jìn)化的過程，利用分子生物學(xué)手段在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，結(jié)合靈敏的篩選技術(shù)，迅速得到理想的突變體。與合理設(shè)計相比，蛋白質(zhì)定向進(jìn)化在不清楚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的情況下，可以得到具有預(yù)期特性的新蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化是蛋白質(zhì)工程的有效手段，其應(yīng)用的領(lǐng)域逐漸擴大，遍及工、農(nóng)、醫(yī)、食品等各方面。

一、定向進(jìn)化的思想、概念和原理

1967年Spiegelman等最先提出分子水平上的體外定向進(jìn)化思想，在隨后幾十年，通過各國生物學(xué)家和其他各界科學(xué)家的努力，這一思想轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實，并融入到人類生產(chǎn)的領(lǐng)域。 定向進(jìn)化是近20年發(fā)展起來的一項新技術(shù)，是達(dá)爾文的進(jìn)化思想在核、肽或蛋白質(zhì)等分子水平上的延伸和應(yīng)用。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機制，在體外對蛋白質(zhì)基因進(jìn)行改造，產(chǎn)生基因多樣性，在結(jié)合定向篩選（或選擇）技術(shù)，獲得所需性能大幅提高的突變體。

定向進(jìn)化是利用Taq-DNA聚合酶不具有3′→5′校對功能的性質(zhì)，并結(jié)合基因工程現(xiàn)有技術(shù)手段，在待進(jìn)化蛋白的PCR擴增反應(yīng)中，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，并構(gòu)建突變庫。憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的突變體，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是：“獲取所篩選的突變體”。與自然進(jìn)化不同，定向進(jìn)化是人為制造特殊條件，模擬自然進(jìn)化機制，使進(jìn)化過程定向進(jìn)行，整個進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的，使蛋白質(zhì)分子朝向人們期望的特定目標(biāo)進(jìn)化。

二、定向進(jìn)化的基本方法

1.易錯PCR

Leung等人發(fā)明了該技術(shù)。易錯PCR（error-prone PCR）是一種簡便快速的在DNA序列中隨機制造突變的方法。其基本原理是通過改變傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中某些組分的濃度（如Mg2+的濃度）、調(diào)整4種dNTP的濃度或使用低保真度的Taq-DNA聚合酶等，使堿基在一定程度上隨機錯誤引入而創(chuàng)造序列多樣性文庫。

2.改組

DNA改組技術(shù)由美國人Stemmer于1994年提出。DNA改組（DNA shuffling）又稱有性PCR（sex-ual PCR），是將目的基因在DNase I的作用下隨機酶切成小片段，再通過PCR重組將這些小片段進(jìn)行PCR反應(yīng)，并重新組裝全長的基因。DNA改組過程中也可能引入新的點突變。因此，DNA改組可以有效地從單一基因系列開始進(jìn)行蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化。DNA改組克服了易錯PCR只能發(fā)生點突變而不能進(jìn)行系列小區(qū)域間交換的缺點，大大提高進(jìn)化效率。DNA改組被認(rèn)為是繼DNA重組之后的又一代基因工程技術(shù)。

DNA改組有以下優(yōu)點：（1）DNA改組可在短時間內(nèi)通過重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進(jìn)化速度；而且對可操作的靶序列沒有任何要求，長度可以達(dá)到幾十kb；（2）通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高；（3）DNA改組從表型上早期進(jìn)行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡化了操作程序；（4）DNA改組比隨機突變顯著提高了良性突變的概率。

3.外顯子改組

外顯子改組（exon shuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段之間進(jìn)行交換，它特別適合于真核生物，自然界中不同分子的外顯子發(fā)生同源重組，導(dǎo)致不同外顯子結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白的重要途徑之一。

4.隨機引發(fā)重組

1998年，Arnold提出了一種有效的新方法——隨機引發(fā)重組（RPR）。隨機引發(fā)重組的原理是：以單鏈DNA為模板，配合一套隨機引物先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的DNA小片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些DNA小片段中會有少量的點突變，在DNA聚合酶作用下，經(jīng)過反復(fù)的熱循環(huán)可重新組裝成全長基因克隆到表達(dá)載體上，隨后篩選。

5.交錯延伸技術(shù)

1998年，Arnold等人建立了一種新的體外重組方法——交錯延伸技術(shù)。交錯延伸是在PCR反應(yīng)體系中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，在熱循環(huán)中大大縮短退火與Taq-DNA聚合酶催化延伸的時間。從而合成出短的新生鏈，在隨后反復(fù)進(jìn)行變性和短暫復(fù)性、延伸過程，直到產(chǎn)生完整的基因長度，最終形成全長雜合基因突變庫。由于模板的轉(zhuǎn)換，大多數(shù)多核苷酸含有不同親本的序列信息。該方法的基因重組程度可通過控制反應(yīng)條件和時間予以調(diào)節(jié)，僅需在一個反應(yīng)管中進(jìn)行，簡化了有性PCR操作。

6.酶法體外隨機-定位誘變

該方法是對目的基因采用隨機突變增加突變位點，以減少篩選突變體的工作量。它通過控制DNA合成底物種類和濃度比例實現(xiàn)堿基對的錯配。

7.定向進(jìn)化的其他方法

近幾年，又相繼出現(xiàn)了一些定向進(jìn)化的新方法，如臨時模板隨機嵌合技術(shù)、外顯子洗牌技術(shù)、SCRATCH技術(shù)、隨機插入/缺失突變、漸增切割法產(chǎn)生親和酶和酵母增強組合文庫。

需要說明的是：以上所表述的重組技術(shù)，任何一種都有缺陷。在實際應(yīng)用中，應(yīng)該針對具體的問題，選擇合適的技術(shù)，以達(dá)到最佳的效果。蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化技術(shù)在一定程度上彌補了定點突變技術(shù)的不足，極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的問題，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，其對潛在的經(jīng)濟、環(huán)境、社會和醫(yī)療的影響是不可預(yù)計的，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)品未來發(fā)展前景是無限的。相信在不久的將來，隨著定向進(jìn)化技術(shù)與理性設(shè)計相結(jié)合，將極大地推進(jìn)進(jìn)蛋白質(zhì)工程以及醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

（作者單位：江西省信豐縣信豐中學(xué)）