郭健　董媛　朱潔　李艷

【摘 要】鐵載體是由細(xì)菌和真菌代謝產(chǎn)生的小分子化合物，在生物醫(yī)藥上有著越來越重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室通過CAS法對(duì)分離自云南境內(nèi)的錫尾礦、湖泊以及鹽礦中的58株真菌進(jìn)行逐步篩選，得到4株鐵載體產(chǎn)生菌，經(jīng)初步鑒定，該4菌均為曲霉屬真菌，證明該屬真菌有著較廣泛代謝產(chǎn)鐵載體的特點(diǎn)，為鐵載體產(chǎn)生菌的后續(xù)研究提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】鐵載體 真菌 CAS 篩選

【Abstract】Siderophores are small molecular compounds produced by bacteria and fungi， which have more and more important application value. Through the CAS method，we screened from 58 strains of fungi isolated from the tin mine tailings ，the salt mine and the lake in Yunnan Province. Finally 4 strains of siderophore-producing fungi were got and all of them were Aspergillus. The result proved that these fungi had extensive metabolic characteristics of siderophore-producing， which provided the basis for the following studies.

【Keywords】Siderophore； fungi；CAS；screening

鐵載體（Siderophores）是一種鐵的鏊合劑， 在鐵缺乏的環(huán)境下鐵依賴性生物體自身分泌的小分子量化合物（小于1500Da），起到吸收和運(yùn)輸鐵的作用[1]。鐵載體對(duì)高鐵離子有高親和力，結(jié)合常數(shù)為1025-1052，可以從宿主體內(nèi)鐵結(jié)合蛋白上攝取鐵[2]。不同的真菌或細(xì)菌產(chǎn)生特定結(jié)構(gòu)的鐵載體[3]。鐵載體對(duì)高鐵離子的較強(qiáng)親和力使得其在生物醫(yī)藥上有越來越重要的應(yīng)用[4]，例如：地中海貧血病是一種典型的鐵過載疾病。紅酵母酸是一種真菌鐵載體， 它可以作為藥物促進(jìn)對(duì)鐵代謝從而達(dá)到治療效果[5]。

本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)58株真菌（分離自云南個(gè)舊大屯錫尾礦，云南程海湖和昆明鹽礦）利用CAS法進(jìn)行檢測(cè)，篩選鐵載體產(chǎn)生菌。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KB，上海申安醫(yī)療器械廠）；電熱培養(yǎng)箱 （PHX-9272 MBE， 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；搖床 （SUKUN SKY-2102 ， 上海蘇坤電器有限公司）。

1.1.2 試劑

CAS-HDTMA溶液（Schwyn B，Neilands B，1987）：A液：60.5mg鉻天青（CAS）溶解與50ml去離子水。加入10ml Fe3+ 溶液（1mM FeCl3﹒6H2O，10Mm HCl），攪拌溶解；B液：72.9mg十六烷基三甲基溴化胺（HDTMA），40ml水，攪拌溶解；A液緩慢與B液混合，115℃滅菌20min。

MM9：KH2PO43g，NaCl 5g，NH4Cl 10g，雙蒸水1000ml。

CAS固體培養(yǎng)基：去離子水750ml，NaOH6.0g，PIPES 30.24g，MM9100ml，瓊脂20g，PH7.4-7.8。115℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至50℃，加入100ml已滅菌的CAS-HDTMA溶液，混勻后倒入平皿。

水解酪蛋白-葡萄糖培養(yǎng)基：水解酪蛋白0.5%，葡萄糖2%，瓊脂2%。121℃滅菌30min。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1L。

促孢培養(yǎng)基（改良的Joffe）：KH2PO41g，KNO31g，MgSO4﹒7H2O 0.5g，KCl 0.5g，淀粉0.2g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，瓊脂 20g，水1000ml，pH自然。

培養(yǎng)基在114℃下滅菌10min，放置培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃下培養(yǎng)24h，再以相同條件滅菌一次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固體發(fā)酵

將CAS固體培養(yǎng)基倒入平皿中，厚度約3mm。待其冷卻凝固后，再倒入2mm厚度的水解酪蛋白-葡萄糖培養(yǎng)基，構(gòu)成了復(fù)式培養(yǎng)基。將58株菌以穿刺接種的方式接種于兩層培養(yǎng)基之間。30℃下恒溫培養(yǎng)。以EDTA作為對(duì)照。

1.2.2 液體發(fā)酵

將菌株接種于100ml PDA液體培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床培養(yǎng)3d。過濾取上清液，以CAS-HDTMA溶液：上清液=1：2的體積滴加加于試管內(nèi)，充分搖晃后，靜止30min。觀察試管內(nèi)顏色變化。

1.2.3 電鏡下觀察菌株形態(tài)

將菌株用促孢培養(yǎng)基進(jìn)行埋片（埋蓋玻片）培養(yǎng)，30℃下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3-5d。收集帶有菌絲體的蓋玻片，晾干48h，待觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 固體培養(yǎng)基篩選結(jié)果

菌體在復(fù)式培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48h后，產(chǎn)鐵載體真菌的菌絲體周圍出現(xiàn)橙色暈圈，如圖1所示。

2.2 發(fā)酵液檢測(cè)結(jié)果

發(fā)酵上清液與CAS-HDTMA檢測(cè)液反應(yīng)，產(chǎn)鐵載體菌的發(fā)酵液加檢測(cè)液后變紅。如圖2所示。

經(jīng)檢測(cè)，有4株真菌在固體培養(yǎng)基上和發(fā)酵液檢測(cè)后均有明顯的顏色變化，因此4株真菌皆為鐵載體產(chǎn)生菌。

2.3 產(chǎn)鐵載體真菌電鏡下的形態(tài)（如圖3所示）

固體培養(yǎng)基上觀察到各個(gè)菌株生長(zhǎng)速度較快。電鏡下觀察到豐富的菌絲和大量孢子。初步判斷以上4株菌株均為曲霉屬（Aspergillus）菌株。

3 結(jié)語

經(jīng)過對(duì)分離自云南自然環(huán)境中的58株真菌的檢測(cè)篩選，得出4株曲霉屬產(chǎn)鐵載體真菌。證明該屬真菌有著較廣泛代謝產(chǎn)鐵載體的特點(diǎn)，為鐵載體產(chǎn)生菌的后續(xù)研究提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Winkelmann G. Importance of siderophores in fungal growth， sporulation and spore germination. In Frontiers in Mycology， CAB International， Wallingford. 1991 （D. L.Hawksworth， ed.）： 49-65.

[2]Neilands JB. Microbial iron compounds [J]. Annu Rev Biochem， 1981，50（1）：715-731.

[3]Haselwandter K. Structure and function of siderophores producedby mycorrhizal fungi[J]. Mineral Mag，2008，72（1）：61-64.

[4]Day JP， Krill P. The chemistry of desferrioxamine chelation for aluminium overload in renal dialysis patients[J]. Therc Drug Monit， 1993， 15（6）： 598-601.

[5]Faa G， Crisponi G. Iron chelating agents in clinical practice[J]. Coord Chem Rev， 1999， 184（1）：291-310.